Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l'identification des médicaments immunomodulateurs

Toutes les expériences sont réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Conseil de l'Université Lab Animal Care et l'utilisation Comité et Institutional Review Wright State. REMARQUE: Les PBMC humaines sont isolées par gradient de densité de Ficoll procédé de centrifugation 5. 1. Spleen Récolte Maison adultes de souris ICR femelles dans des conditions de laboratoire standard avec les aliments, l' eau, les exigences et de literie spécifiques à l'espèce. NOTE: Les animaux avaient un âge moyen de 2,9 mois et un poids moyen de 30,4 g au moment de l'euthanasie. À la date de l'isolement (DOI), euthanasier les animaux individuellement sans autres animaux conspécifiques présents. Faire tous les efforts pour assurer un minimum de stress à la souris. Euthanasier utilisant le CO 2 à la dislocation cervicale secondaire pour assurer la mort. Placez l'animal, toujours à l' intérieur de la cage de transfert, dans la chambre de CO 2 et de statempérature ambiante, le flux de gaz à 5 L / min. Ce débit déplace l'oxygène à la recommandation 10-30% par min. Après que l'animal est inconscient, d' augmenter le débit de CO 2 et 15 L / min. Vérifiez l'animal à l'arrêt de la respiration et de laisser dans la chambre pendant 2 min. Appliquer dislocation cervicale avec une force de distraction pour assurer la mort. Récolter la rate de l'animal en utilisant une technique aseptique à moins de 10 min de la mort. Stériliser les deux ensembles de ciseaux et des pinces pour l'ablation de la rate dans un four autoclave avant utilisation. Stériliser la surface de dissection par application d'éthanol à 70%. Appliquer 70% d'éthanol dans l'abdomen de la souris. L'utilisation d'un ensemble de ciseaux et des pinces, faire une coupe dans la fourrure et de la peau à partir du côté gauche de l'abdomen, puis tirer à part et peler la peau pour révéler le péritoine. Une fois exposée, appliquer une solution de chlorhexidine à 4% avant l'ouverture du péritoine. Utilisation de la deuxième série de sciencessors et forceps, faire un 2 à 3 cm découpe le long de l'abdomen central. Ouvrez le péritoine et enlever la rate en coupant les attachements viscéraux et l'excès de graisse. Placer la rate dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS). 2. Préparation des premières splénocytes REMARQUE: Effectuer toutes les étapes sous une armoire flux de biosécurité laminaire en utilisant une technique aseptique. Faire tremper les rates récoltées dans 10 ml de désionisée H 2 O stérile pendant 5 min dans une boîte de culture de 10 cm pour lyser les érythrocytes de surface. REMARQUE: Cette étape peut être omise si la rate a été endommagé lors de l'isolement. Pour libérer les splénocytes, écraser les rates entre deux lames de verre stérilisés (côté givré face à la rate) sur une boîte de culture de 10 cm frais. Mélanger avec 10 ml de RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine, 50 UI / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (ci-après fait référence à uns RPMI complet). Filtrer les cellules à travers une cellule de 40 um nylon filtre stérile dans une nouvelle boîte de culture de 10 cm pour retirer le tissu conjonctif et les débris. Lyser les globules rouges restants de : en ajoutant 20 ml de tampon de lyse RBC composée de 155 mM de NH4CI, 10 mM de NaHCO 3 et 0,1 mM d' EDTA à pH 7,4 et ~ 300 mOsm / L. NOTE: L'osmolalité est mesurée par un point de congélation ou d'un osmomètre à pression de vapeur. Transférer les cellules de la plaque de 10 cm dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge à 250 g pendant 10 min (4 ° C). Retirer le surnageant, ajouter 20 ml de tampon de lyse RBC, et remettre en suspension les cellules sédimentées par pipetage. Incuber à température ambiante dans le tampon de lyse pendant 10 min avec doux balancement. Centrifuger pendant 10 min à 250 x g (4 ° C) pour sédimenter les cellules. Verser le tampon de lyse. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de RPMI complet et centrifuger à nouveau (250 xg, 10 min, 4 ° C). Disqueard le surnageant. Remettre en suspension les splénocytes dans 2 ml de RPMI complet chauffé à 37 ° C pour transvaser dans la colonne de nylon de fibres de laine. 3. Purification de lymphocytes T Laver les colonnes de laine de nylon à deux reprises avec 5 ml de RPMI complet. Incuber à 37 ° C dans une culture cellulaire CO 2 incubateur à 5% pendant 1 heure. NOTE: Il est impératif de maintenir la laine de nylon humide pendant toute la durée de l'expérience et d'utiliser RPMI complet chauffé à 37 ° C pour toutes les étapes d'isolation de laine de nylon. Ajouter des splénocytes isolés à la colonne et on incube pendant 1 heure pour permettre aux cellules B, les fibroblastes et les cellules accessoires à adhérer à la laine de nylon. Ajouter 2 ml de RPMI contenant les splénocytes dans la colonne et passe à travers jusqu'à ce que la partie supérieure de la laine de nylon est atteinte. Ajouter 2 ml de RPMI complet chauffé à 37 ° C au-dessus de la laine de nylon et de passer le milieu à travers la lainejusqu'à ce que le niveau du liquide atteint la surface supérieure. Ajouter 3 ml de chaud RPMI complet à la colonne pour couvrir complètement la laine de nylon. Incuber la colonne chargée non perturbée dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture cellulaire pendant 1 h. Éluer les cellules par lavage de la colonne deux fois avec 5 ml de RPMI complet. Effectuer un lavage supplémentaire des cellules éluées par centrifugation. Remplir la colonne 2 derniers fois avec RPMI complet et laisser la solution dans la colonne de circuler à travers dans un tube conique stérile de 50 ml. REMARQUE: Évitez taraudage ou de heurter la colonne, qui peut déloger les cellules B, les cellules accessoires, et les fibroblastes adhérant à la laine de nylon. Recueillir la fraction et de spin accréditives à 250 xg pendant 10 min (4 ° C) pour sédimenter les cellules. Laver une fois avec 10 ml de RPMI complet. Sédimenter les cellules à nouveau (250 x g, 10 min, 4 ° C) et remettre en suspension dans 2 ml de RPMI complet. Mesurer la c densité ell utilisant un hémocytomètre et on dilue dans du RPMI complet à 0,5 x 10 6 cellules / ml. Semences 1 ou aliquotes de 2 ml de cellules dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire 24 ou 6 puits, respectivement, et la culture des cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. NOTE: 1 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT) peut être ajouté à chaque puits à ce stade pour améliorer la survie des cellules T. Facultatif: Confirmez l'efficacité du protocole d'isolement par cytométrie de flux. Ce protocole donne normalement ~ 80% des lymphocytes T 23. NOTE: les cellules de laine purifiée nylon contiennent environ 50% CD4 + et 23% cellules CD8 +. Pour purifier les cellules CD4 + et CD8 + en outre les sous – populations, une seule étape de déplétion immunomagnétique peut être réalisée à l' aide de huit anticorps et des billes magnétiques 24. En variante, plus pur CD4 + et les populations de lymphocytes T CD8 + peuvent être isolées par sélection positive ou négative avec des anticorps spécifiques. _title "> 4. Activation des lymphocytes T et l'exposition au médicament expérimental Activer les lymphocytes T dans les 24 heures d'isolement par l'ajout de PMA et ionomycine sel de calcium ou de billes magnétiques recouvertes d'anti-CD28 des anticorps anti-CD3 23,25,26 et. Ajouter des médicaments expérimentaux (par exemple, CsA, FK506, la rapamycine, TRAM-34, et FTY720) au moment de l' activation. Remarque: ici, les concentrations de PMA varie de 2 à 250 ng / ml, et la concentration ionomycine a été maintenue à 250 nm. Si possible, les dilutions doivent être préparées à partir de stocks aliquotes de chaque médicament de telle sorte que le volume ajouté à chaque puits de cellules est ≥1 ul pour assurer la reproductibilité. des billes magnétiques anti-CD3 / anti-CD28 enrobées sont ajoutées à un rapport 1: 1 bourrelet à cellule. L' augmentation du nombre de billes par cellule (ie, le rapport bourrelet à cellule) va augmenter l'intensité de la stimulation 25,26. Les billes sont lavées et remises en suspension dans RPMI complet avant leur addition aux cellules. On notera que trypanbleu colore les perles. La culture des cellules pendant 12-72 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2 avant l' analyse avec le compteur de cellules automatisé. 5. Cellule automatisée Collection Compteur de données Avant d' exécuter l'exemple, assurez – vous que les cellules sont mélangés doucement avec une pipette sérologique pour éviter les grumeaux. Ceci est particulièrement important pour les lymphocytes activés en raison de leur adhésivité accrue. Pour les cultures qui sont activées avec des billes anti-CD3 / CD28, après le pipetage, le transfert de l'échantillon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml ou 2 ml. Séparer les perles en gardant le tube sur un aimant pendant 1-2 min. Utiliser le surnageant contenant les cellules pour l'analyse. Remarque: analyser les deux cellules au repos et activés à moins de 1 heure pour prendre en compte tout pré-activation des cellules au repos par le sérum présent dans le milieu de culture. Après 12 h de PMA / ionomycine stimulation, une légère augmentation de la taille des cellules était détectable (Figure 2 </strong>). À 72 h, aucune augmentation significative de la taille des cellules par rapport à 48 h a été observée (données non présentées). Transfert 1 ml de la suspension cellulaire dans un échantillon tasse et le lancer à travers le compteur de cellules automatisé selon les instructions du manuel. NOTE: Pour chacun des essais, un minimum de 1 ml (maximum de 2 ml) de la culture cellulaire doit être utilisée. Le compteur de cellules automatisé utilise une seringue pour mélanger bleu trypan avec la suspension cellulaire et passe le mélange bleu-trypan cellule sur un champ qui est imagée et analysé par le logiciel. Le logiciel détecte les cellules colorées en bleu trypan, dessine un cercle autour de chaque cellule, et qui détermine le diamètre. 100 images sont prélevées dans chaque échantillon et la viabilité des cellules et les dimensions sont déterminées. Le seuil de détection du compteur cellulaire utilisé ici a une limite inférieure de 5 um. Transfert des données de chaque parcours vers un tableur pour une analyse ultérieure. Calibrer l'appareil sur une base régulière en utilisant un 1ml échantillon de 6 pm et 8 pm perles diamètre de polystyrène. REMARQUE: Les tailles de perles réelles mesurées par le fabricant pour chaque lot doit être utilisé, pas la taille nominale. 6 et 8 um perles sont pratiques parce que ces diamètres sont proches des diamètres attendus de repos et les cellules T activées (voir Figure 1). 6. Les données et l'analyse statistique Analyser les données en utilisant un logiciel statistique et graphique approprié. NOTE: La feuille de calcul pour chaque exécution contient le nombre de cellules avec chaque diamètre (plage: 5 um à 70 um). Les cellules au-dessus d'un diamètre de 17 um sont retirés de l'analyse d'exclure les particules de poussière et de petites bulles, qui peuvent être lues comme des cellules viables par l'instrument. Effectuer l'hypothèse d'essai utilisant le test t de Welch pour les ensembles de données avec une variance inégale; les résultats sont considérées comme statistiquement significatives si p <0,001. La formule utilisée était, <img alt = "Equation 1" src = "/ files / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg" /> où et sont des moyens échantillons, et sont variances échantillon, et et sont la taille des échantillons pour chaque ensemble de données. Le nombre de degrés de liberté est une estimation prudente en utilisant la plus petite des deux tailles d'échantillon pour chaque comparaison. Les graphiques à barres sont présentées comme la moyenne ± SEM. 7. splénique T-lymphocyte Essai de prolifération Mesurer la prolifération des lymphocytes T en utilisant une plaque ou MTS- dosage colorimétrique lecteur de prolifération à base de MTT. NOTE: L'essai est la based sur le composé tétrazolium MTS (réactif d'Owen) de réduction de produit de formazan soluble, probablement par le NADPH ou NADH produit dans des cellules métaboliquement actives par des enzymes déshydrogénase. Compter les cellules T purifiées avec un hémocytomètre et remettre en suspension les dans RPMI-1640 complet à une densité finale de 1 x 10 6 cellules / ml. REMARQUE: DTT 1 mM peut être ajouté aux cellules à ce stade. Activer les cellules avec PMA et ionomycine avec des médicaments d'essai, le cas échéant, et mélanger doucement (similaire à l'étape 4). Plaque 100 pi de cellules dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire traitée à 96 puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Ajouter 100 pi de milieu RPMI-1640 sans cellules dans un puits pour obtenir une lecture de l'absorbance de fond. Ajouter 20 ul de réactif à base de MTS à chaque puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 4 heures. Prendre des mesures d'absorbance à 490 nm en utilisant un lecteur de plaque. Le ALes mesures de bsorbance correspondent au nombre de cellules métaboliquement actives dans chaque puits. NOTE: Soustraire les niveaux de fond si nécessaire. Les valeurs d'absorbance de fond dépendent du type de milieu de culture, le sérum, le pH externe, et la durée de l'exposition au réactif MTS à la lumière. réactifs à base de MTS sont sensibles à la lumière, et l'exposition à la lumière pendant plusieurs heures peuvent entraîner une hausse des valeurs d'absorbance de fond.