الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية
Summary
T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
Abstract
انتشار الخلايا اللمفاوية ردا على الأنتيجين أو التحفيز مولد للتفتل ظاهرة قابلة للقياس بسهولة مفيدة لاختبار المناعية (أي مناعة أو يمونوستيمولاتوري) المركبات الكيميائية والبيولوجية. واحدة من أولى الخطوات خلال mitogenesis هو توسيع الخلية أو التحول مأرمي المنشأ، وعندها يزداد حجم الخلايا قبل التقسيم. وهي عادة ما تكون كشفها في عدة ساعات الأولى من التحفيز الخلايا اللمفاوية التائية. هنا، نحن تصف طريقة سريعة لتحديد مأرمي في الخلايا اللمفية تي المعزولة من الطحال الماوس وهامشية خلايا الدم وحيدات النوى الإنسان (PBMCs) باستخدام عداد الخلية الآلي. مختلف المقايسات انتشار شائعة الاستخدام بالنسبة للجزء الأكبر هي شاقة وتعكس سوى تأثير إجمالي عدد السكان بدلا من الآثار الخلوية الفردية بين السكان. في المقابل، يقدم عرض آلية فحص خلية مكافحة قياسات سريعة ومباشرة، ودقيقة من أقطار الخلية التي يمكن أن تكونتستخدم لتقييم فعالية مختلف mitogens والأدوية المناعية في المختبر.
Introduction
اللمفاويات التائية هي الخلايا الأولية المسؤولة عن المناعة التكيفية في الثدييات. ومن المعروف أن تستجيب لالببتيدات المستضدات محددة قدمها جزيئات MHC على سطح الخلايا المقدمة للمستضد. على تفعيل مستقبلات الخلايا التائية وما شابه ذلك (TCR)، الخلية يوسع في عملية تسمى التحول مأرمي المنشأ، أو مأرمي. هذه العملية هي التي يمكن اكتشافها في أول ~ 6 ساعات بعد تطبيق التحفيز 1. خلال مأرمي، وحجم خلايا T الفردية زيادة 2- 4 أضعاف 2-6. الخلايا الليمفاوية تبدأ في الانتشار في عملية تسمى التوسع نسيلي، والغرض منه هو توليد أكبر عدد ممكن من الحيوانات المستنسخة من TCR الحاملة للخلايا مستضد معين ممكن. الخلايا ذرية ثم تمارس وظيفتها المناعية عن طريق التفريق في السامة للخلايا (CD8 +) أو المساعد (CD4 +) المستجيب الخلايا اللمفية تي. وهكذا، الخلايا اللمفية تي ساذجة في الدم البشري أو الماوس هي في مرحلة G 0 (يستريح) للخليةدورة والحد الأدنى من الدعم النشاط الأيضي. عند التعرض لمستضدات أو mitogens، وخلايا T إعادة إدخال دورة الخلية، مع ما يصاحب ذلك من التحفيز النسخ وتخليق البروتين 7-10. Mitogens، مثل phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وionomycin تحفيز الخلايا الليمفاوية من خلال تفعيل بروتين كيناز C (بي كي سي) والكالسيوم 2+ إشارة معتمد على مسارات 1. تنشيط خلايا T مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin يتجاوز الخطوات يشير TCR.
في انتشار المختبر وتستخدم على نطاق واسع المقايسات لغرض تقييم وظيفة الخلايا اللمفاوية والاستجابة للمؤثرات. تؤخذ قراءات انتشار عادة بعد 1-3 أيام من بدء التحفيز خلايا T وتعكس حالة جماعية لمئات أو آلاف من الخلايا. قوة من مختلف mitogens والأدوية المناعية في المختبر يمكن تقييمها ببساطة عن طريق قياس معدلات انتشار في وجود هذه المركبات. بعض من هذه لوتناقش ssays وحدودها أدناه.
لالمباشر عد عدد الخلايا، وإجراء يستغرق وقتا طويلا، مع احتمال كبير لأخطاء المشغل.
لتخليق الحمض النووي، إدراج فحص-3H الثيميدين يقيس الحمض النووي، ولكن القيد الرئيسي هو الإشعاعية لها. وثمة بديل غير المشعة هو BrdU، ولكن مجموعة من استجابة خطية لنمو الخلايا غير محدود، ومطلوب علاج الأجسام المضادة، مما يزيد من عدد من الخطوات في الإجراء 11،12.
للالنشاط الأيضي، وأملاح نتروبلو (الإنتقالي العسكري، MTS، XTT، وWST-1) وريسازورين المقايسات اللونية القائمة على صبغ تقرير الدولة الأيض العامة للتقسيم السكان الخلية. ومع ذلك، الإنتقالي العسكري يست قابلة للذوبان في مستنبت، والتي تتطلب خطوات غسل إضافية، وبالتالي دمج الأخطاء في القياس؛ XTT تحتاج مكونات إضافية للحد من كفاءة؛ MTS-، WST-1-، والقياسات ريسازورين هي تؤثرإد من درجة الحموضة مستنبت ومكوناتها مصل، الزلال أو الفينول الأحمر 13-16. هذه المقايسات لا تقيس العدد الفعلي للخلايا قابلة للحياة، بل تقدير الأنشطة الإنزيمية مجتمعة. ولذلك، فإن معدل الانتشار النووي قد لا يتم تحديدها بدقة عن طريق فحوصات الأيض بسبب علاقة غير خطية بين عدد الخلايا والحد من صبغ 12،17.
لقياس تركيز ATP، تي خلية الزيادات الناجمة عن التنشيط في ATP ترتبط مع انتشار. ومع ذلك، والارتفاع للاعبي التنس المحترفين داخل الخلايا هي واحدة من الخطوات الأولى لتفعيل الخلايا التائية. العديد من الخطوات وراء انتشار الفعلي 17،18.
لصبغ تخفيف الفحص، CFSE صبغة الفلورسنت بقع الخلايا عن طريق ملزمة تساهميا إلى البروتينات داخل الخلايا. يظهر الصبغة انخفاض تعتمد على الانتشار في كثافة الفلورسنت، والتي يمكن تتبع عدد من انقسامات الخلية. ومع ذلك، بسبب التساهمية البروتين وضع العلامات، وظائف هذهالبروتينات يمكن أن يتعرض للخطر. صبغة غير سامة للخلايا في تركيزات أعلى. بتركيزات صبغ أقل، ومع ذلك، يتم تقليل كثافة مضان الأولية، وخفض عدد من الانقسامات الخلوية التي يمكن تتبعها. بالإضافة إلى ذلك، بعد وضع العلامات مع CFSE، هناك خسارة 50٪ الانتشار مستقلة ~ مضان الأولي خلال الفترة الأولى 24-48 ساعة، الأمر الذي يحد من مجموعة ديناميكية من هذا الاختبار 19،20.
معظم هذه المقايسات تعكس الحالة الجماعية أعداد كبيرة من الخلايا وتتطلب علاج الخلايا مع الأصباغ الفلورية. قد تساهم الخلايا الميتة وأفكارك أيضا إلى هذه القياسات، ما لم تتم إزالتها من التحليل من قبل تلطيخ مع المواد الكيميائية أو الأجسام المضادة.
اللمفاويات مأرمي يمكن تقييمها من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل المجهر الضوئي أو قياس التدفق الخلوي 4،21،22. هنا، نحن تصف طريقة سريعة لقياس أحجام تي خلية باستخدامن الآلي مكافحة الخلايا، الذي يجمع الصور خلية في الوقت الحقيقي التي يتم تخزينها ويمكن إعادة تحليلها في وقت لاحق. بالإضافة إلى قياسات حجم هذا الجهاز يوفر أعداد الخلايا دقيقة والنسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة، على النحو الذي يحدده التريبان الاستبعاد وصمة عار الأزرق. الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول متاح تجاريا، والشركة المصنعة اختبار دقة الصك استخدام ثلاث أدوات مختلفة والعديد من الضوابط التركيز وقدرتها على البقاء. أظهرت نتائج هذه الدراسات وجود معامل التباين التي كانت عموما أقل من 6٪. كما لوحظ في البروتوكول، يتم معايرة الجهاز على أساس منتظم مع 6 ميكرون و 8 ميكرومتر الخرز البوليسترين قطر. مزايا استخدام عداد خلية للتمييز بين الخلايا التائية يستريح والابيضاض اللمفاوي T على أساس قطر الخلية هي سهولة الاستخدام وطبيعة الآلية لإدارة التحليل. البرنامج قادر على رسم دائرة حول كل خلية وحساب قطر الخلية. بالإضافة إلى ذلك، ايمالأعمار واضحة للمشغل الذي يمكن التحقق من دقة الصك في تحديد الخلايا وبشكل صحيح رسم دائرة من حولهم. من حيث القيود، وأداة يست في حد ذاتها يمكن التفريق بين الحطام والخلايا. وبالتالي، فمن المهم أن المشغل يرى كل صورة كما يتم معالجتها. هناك إمكانية لدمج فقاعات الهواء، والذي سيقلل من عدد من المجالات التي يمكن استخدامها في التحليل؛ ولكن هذا أمر نادر الحدوث إذا أجري الصيانة التنظيف العادية.
في هذه الدراسة، تم تحفيز مجموعات من الخلايا اللمفية تي الطحال مع ionomycin وزيادة تركيزات سلطة النقد الفلسطينية ل12-48 ساعة. تركيزات سلطة النقد الفلسطينية منخفضة تصل إلى 2 نانوغرام / مل يسببها كلا استجابة مأرمي المنشأ قوية وانتشار كبير. قياسات آثار العديد من الأدوية، مثل مثبطات المناعة السيكلوسبورين ألف (CSA)، FK506 (تاكروليماس)، وrapamycin (sirolimus و)، وكذلك حاصرات قناة أيون الترام-34 و FTY720 (fingoliوزارة الدفاع)، ويتجلى في مأرمي اتفاق جيد مع الآثار تقريرا عن انتشار الأسلحة النووية. كما تم قياس استجابة مأرمي المنشأ من PBMCs الإنسان لسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin والفئران تحفيز خلايا T مع anti-CD3 ومكافحة CD28 الخرز المغناطيسي المغلفة الأضداد.
فحص خلية مكافحة يقيس كلا مأرمي ومعدل انتشار (كثافة الخلية) في وقت واحد ولكن بشكل منفصل، على عكس الطرق المذكورة أعلاه، والتي تبدو في مزيج من هذه الآثار. وينص بروتوكول المعروضة تقنية سريعة وقوية لتقييم فعالية وكلاء مولد للتفتل والمناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف تقنية للكشف السريع النوعي والكمي لخلايا T التحول مأرمي المنشأ باستخدام عداد الخلية الآلي. في ظل ظروف لدينا (250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin التحفيز)، تمت زيادة مساحة سطح الخلية شقين وحجم ثلاثة أضعاف بعد 48 ساعة من التنشيط. الفحص حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التفجير خلال ساعة الأولى 12 من التنشيط، حيث زاد حجم الخلية فقط 1.25 أضعاف مقارنة يستريح (الشكل 2D). آلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لتنشيط خلايا T استخدام الألغام المضادة للCD3 ومكافحة CD28 الخرز المغناطيسي المغلفة الأجسام المضادة تنتج استجابة مأرمي المنشأ كبيرة، بمتوسط زيادة 2.3 أضعاف في حجم (72 ساعة بعد التنشيط، الشكل 3D). وأظهرت الخلايا وحيدة النواة الإنسان تغييرا 2.6 أضعاف في حجم على سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin التحفيز لمدة 48 ساعة (الشكل 4). تم تحديد متوسط قطرها مجلس النواب الماوس الطحال الخلايا التائية وحجم لتكون6.9 ميكرون و 1.9 × 10 -4 نيكولا لانغ، على التوالي. PBMCs الإنسان (من متبرع سليم واحد) وكان متوسط قطرها 7.7 ميكرون ومتوسط حجم 2.7 × 10 -4 نيكولا لانغ. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن اختبار أيضا زيادة تركيزات سلطة النقد الفلسطينية لقدرتها على تنشيط خلايا تي. وكانت هذه النتائج خلية واحدة متسقة مع المقايسات انتشار أجريت في تركيزات سلطة النقد الفلسطينية مماثلة.
تم اختبار عدة مركبات ذكرت أن تؤثر على تكاثر الخلايا: FTY720 31،32. ومناعة السيكلوسبورين A، FK506، وrapamycin 27،28. والترام، 34 عاما، وهو مانع من القنوات KCa3.1 تنشيط الكالسيوم 33،35. لقد وجدنا أنه في تركيزات اختبار، كانت مثبطات أقوى من مأرمي وكالة الفضاء الكندية وFK506. كان Rapamycin تأثير أصغر ولكن ذات دلالة إحصائية القمعية على مأرمي. الترام-34، من ناحية أخرى، لم يؤثر مأرمي.
قمعت وكالة الفضاء الكندية على حد سواء مأرمي وصroliferation، ولكن ليس تماما (الشكل 2B و2C)، مما يدل على أن آلية قياس خلية مكافحة ينتمي إلى المترابطة جيد من الكفاءة المخدرات في انتشار الخلايا التائية. في ظل وجود rapamycin جنبا إلى جنب مع وكالة الفضاء الكندية، وكانت مأرمي تحول دون تماما، مما يشير إلى أن مسارات NFAT- وmTOR س بوساطة في تركيبة يمكن تحميلها مسؤولية توسيع الخلايا التائية على التحفيز مولد للتفتل مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin (الشكل 3C).
مجموعة ديناميكية من بعض المقايسات انتشار محدودة (انظر الشكل 2). المقايسات انتشار الأسلحة النووية، مثل واحد ونحن قد استخدمت (الشكل 2C)، تقريرا إشارة إلى أن يتضمن مساهمات من الخلايا أفكارك والميتة. آلية قياس التغيير قطر لا تملك هذا الحد، كما تتعلق القياسات إلى خلايا قابلة للحياة فقط. ويتم تقييم الجدوى الخلية عن طريق استبعاد وصمة عار الزرقاء التريبان من الخلايا السليمة، قابلة للحياة. في قياسات حجم، وذلك باستخدام الأمامالضوء المبعثر في التدفق الخلوي التمييز خلية صدرة يمكن أن يكون مشكلة 22. في القياسات الآلي خلية مضادة، لم يتم العثور على السكان صدرة (الشكل 1). أيضا، كان القياس دقيقا بما فيه الكفاية للتمييز بين الآثار 100 و 200 نانومتر السيكلوسبورين (الجدول 1) وللكشف عن مأرمي غضون 12 ساعة من التحفيز مولد للتفتل (الشكل 2D).
هذا الاختبار الجديد هو مفيدة بشكل خاص لأعداد صغيرة من العينات. ما يصل الى 15 عينات يمكن قياسها في 1 ساعة. ومع ذلك، فإن فحص له حدوده، ومعظمها يمكن تخفيفها. على الرغم من أنه يمكن حل فعال صغير الفرق (<1 ميكرون) في قطر الخلية، ونموذج الجهاز كنا له عتبة الكشف أقل من 5 ميكرون. هذا الحد يمكن أن يسبب المبالغة في تقدير الأحجام زنزانة صغيرة جدا، لأنها تستبعد بشكل فعال جميع الخلايا ذات أقطار صغيرة. ومع ذلك، النماذج الجديدة من العداد المحمولة لديها الكشف درس الحنطةالذين تتراوح أعمارهم بين من ~ 2 ميكرون، والتي ينبغي تخفيف من حدة هذه المشكلة. إذا كان هناك الكثير من الحطام في العينة، وأداة يعامل بها خلايا قابلة للحياة كما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على فقاعات الهواء من حين لآخر في الخلية التدفق وتسبب تشويه الصور الخلية التي تم التقاطها بواسطة آلة. لا يظهر تشويه للتأثير على تقرير جدوى، ولكنه يمكن أن يؤثر على بأقطار قياسها. ولذلك، فمن المستحسن أن يتم فحص جميع الصور من قبل المجرب لفقاعات الهواء قبل أن يتم قبولها البيانات من كل محاكمة لتحليلها. منذ البرمجيات توجه فقط دوائر حول الخلايا، قد يكون بأقطار من الخلايا غير كروية ينحرف تجاه المحور الطويل، مما يجعل فحص أقل ملاءمة للخلايا غير كروية.
هذا الاختبار هو سريع، مع ما يقرب من 4 دقائق لكل عينة، بالمقارنة مع المقايسات انتشار الأسلحة النووية، التي تتطلب بضع ساعات. جمع البيانات أيضا بسيطة وليس باستخدام البرنامج المرفق مع الجهاز. البرنامج يمكن تصدير بيانات القياس ليرة سوريةreadsheet للتحليل. وأخيرا، فإنه هو وحيد الخلية، بدلا من عدد السكان، القياس؛ يتم قياس كل من مأرمي وانتشار. ويميز بين خلايا قابلة للحياة والميتة في وقت واحد. ويمكن استخدامه لتقييم سلالات الماوس المختلفة لقدرتها على شن استجابة مناعية. يمكن أيضا فحص استخدامها بنجاح لقياس مأرمي في الخلايا التائية من الجهات المانحة الإنسان (الشكل 4)، ويمكن أن تستخدم أيضا في أنواع أخرى من الخلايا.
ومن المعروف أن زيادة حجم الخلية للمساهمة في تنظيم عملية التمثيل الغذائي: خلية تورم يحفز الناجم عن الجلوتامين توليف الجليكوجين وتكون الدهون في خلايا الكبد 36،37. العدلات عرض زيادة حجم الهجرة المرتبطة من 35-60٪، في حين أن وكلاء الكيميائي لحث على 10-15٪ تورم 38-40. من المحتمل أن الفحص الحالي أن تستخدم لدراسة هذه العمليات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
Materials
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
- Weiss, A., Samelson, L. E., Paul, W. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. , 321-364 (2003).
- Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
- Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
- Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
- Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
- Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
- Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
- Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
- Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
- Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
- Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
- Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
- Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 410-412 (2004).
- Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
- Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
- Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
- Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
- Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
- Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
- Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
- Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
- Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
- Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
- Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
- Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
- Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
- Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
- Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
- Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
- Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
- Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
- O’Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
- Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
- Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, C1623-C1632 (1994).
