T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
抗原または分裂刺激に応答したリンパ球増殖は、試験免疫調節のために有用な、容易に定量化現象( すなわち、免疫抑制または免疫賦活)化学化合物および生物学的製剤です。有糸分裂中の最も初期の段階の一つは、分割前のセル体積が増加するところ、細胞肥大または幼若変換です。これは、Tリンパ球刺激の最初の数時間で通常は検出可能です。ここでは、自動細胞カウンターを用いて、マウスの脾臓及びヒト末梢血単核細胞(PBMC)から単離したTリンパ球芽球を定量するための迅速な方法を記載します。ほとんどの部分のための様々な一般的に使用される増殖アッセイは面倒であり、唯一の集団内の全体的な人口の効果ではなく、個々の細胞効果を反映しています。対照的に、提示される自動細胞計数アッセイすることができる細胞直径の、迅速な直接、正確な測定値を提供します種々のマイトジェンおよびインビトロでの免疫調節薬の有効性を評価するために使用されます。
Tリンパ球は、哺乳動物における適応免疫を担う主要な細胞です。それらは、抗原提示細胞の表面上のMHC分子によって提示される特定の抗原性ペプチドに応答することが知られています。コグネイトT細胞受容体(TCR)の活性化の際に、細胞プロセスに大きく幼若転換、または芽球と呼ばれます。刺激が1に適用された後に、この処理は、第1〜6時間で検出可能です。幼若時には、個々のT細胞の体積が2〜4倍に2-6を高めます。リンパ球クローン性増殖と呼ばれるプロセスで増殖し始め、その目的は、可能な抗原特異的なTCRを有する細胞のような多くのクローンを生成することです。子孫細胞は、次いで、細胞傷害性(CD8 +)またはヘルパー(CD4 +)エフェクターTリンパ球に分化することによってそれらの免疫学的機能を発揮します。したがって、ヒトまたはマウスの血液中のナイーブTリンパ球は、細胞のG 0(静止)期にありますサイクルおよびサポート最小限の代謝活性。抗原またはマイトジェンに曝されると、T細胞は、転写およびタンパク質合成7-10の同時刺激と、細胞周期を再入力します。例えばホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)およびイオノマイシンのようなマイトジェンは、プロテインキナーゼC(PKC)の活性化及びCa 2+依存性シグナル伝達経路1を介してリンパ球を刺激します。 PMA /イオノマイシンでのT細胞の活性化は、TCRシグナル伝達の手順をバイパスします。
インビトロでの増殖のアッセイは広くリンパ球機能及び刺激に対する応答を評価するために使用されます。増殖の測定値は、典型的には1〜3日のT細胞刺激の開始後に採取した細胞の数百または数千の集合的な状態を反映しています。 インビトロでの種々のマイトジェンおよび免疫調節薬の効力は、単に、これらの化合物の存在下での増殖速度を測定することにより評価することができます。これらのAの一部ssaysとその限界について、以下に説明します。
直接細胞数を計数するために、手順は、オペレータエラーの高い確率で、時間がかかります。
DNA合成のために、3 H-チミジン取り込みアッセイは、DNA合成を測定し、その主な制限は、その放射性毒性です。非放射性代替法は、BrdUのであるが、細胞増殖のための線形応答の範囲は限られており、抗体治療は、手順11,12のステップの数を増加させる、必要とされます。
代謝活性のために、テトラゾリウム塩(MTT、MTS、XTT、およびWST-1)と染料系比色アッセイをレサズリンは、細胞集団を分割する一般的な代謝状態を報告します。しかしながら、MTTはこのように測定誤差を組み込んだ、追加の洗浄工程を必要とする、培養培地中に溶解しません。 XTTを効率的に低減するために追加のコンポーネントを必要とします。 MTS-、WST-1-、およびレサズリンベースの測定値が影響しています培養液のpHとそのコンポーネントの血清、アルブミンまたはフェノールレッド13-16によってエド。これらのアッセイは、生存細胞の実際の数を測定するのではなく組み合わせた酵素活性を推定しません。従って、増殖速度を正確ため、細胞数及び色素還元12,17間の非線形相関の代謝アッセイによって決定されなくてもよいです。
ATP濃度を測定するために、ATPでT細胞活性化によって誘導される増加は、増殖と相関します。しかし、細胞内ATPの上昇は、T細胞活性化の初期ステップの一つです。多くの手順の背後にある実際の増殖17,18です。
色素希釈アッセイのために、CFSE蛍光色素は、共有結合、細胞内タンパク質に結合することにより細胞を染色します。色素は、細胞分裂の数を追跡することができる蛍光強度の増殖依存的な減少を示しています。しかし、共有結合タンパク質標識のために、これらの機能タンパク質が損なわれる可能性があります。色素が高濃度で細胞に対して毒性です。より低い色素濃度では、しかし、最初の蛍光強度を追跡することができる細胞分裂の数を減少させる、減少されます。また、CFSEで標識した後、このアッセイ19,20のダイナミックレンジを制限する最初の24〜48時間の期間、中に初期蛍光の増殖に依存しない〜50%の損失があります。
これらのアッセイのほとんどは、多数の細胞の集団の状態を反映し、蛍光色素を用いた細胞の処置を必要とします。彼らは化学物質や抗体で染色することによって分析から除外されない限り、壊死およびアポトーシス細胞はまた、これらの測定値に寄与する可能性があります。
リンパ芽球は、光学顕微鏡のように、種々の方法により評価又はサイトメトリー4,21,22を流すことができます。ここでは、使用したT細胞の大きさを測定するための迅速な方法を記載しますnは保存され、後で再分析することができるリアルタイムの細胞画像を収集し、細胞計数を、自動化されました。トリパンブルー染色排除によって決定される大きさの測定に加えて、このデバイスは、正確な細胞数と生存細胞の割合を提供します。このプロトコルで使用される装置は市販されており、製造業者は、3つの異なる楽器といくつかの濃度及び生存率のコントロールを使用して、機器の精度をテストしました。これらの研究の結果は、一般的には6%未満であった変動係数を示しました。プロトコールに記載されているように、装置は、6ミクロンと8ミクロンの直径のポリスチレンビーズを用いて定期的に較正されます。セル径に基づいて、休止T細胞およびTリンパ芽球を区別するために、細胞計数器を使用する利点は、使いやすさ、および分析の自動化された性質です。ソフトウェアは、各セルの周りに円を描画し、気泡径を算出することが可能です。また、イム年齢層は細胞を同定し、正しくそれらの周りに円を描くには、機器の精度を確認することができ、オペレータに表示されます。制限の面では、器具は、 それ自体は破片と細胞を区別することはできません。従って、処理されるように、オペレータがすべての画像を見ることが重要です。分析のために使用可能なフィールドの数を減少させる気泡を組み込む可能性があります。定期的なフラッシングのメンテナンスが行われる場合は、これはまれです。
この研究では、脾臓のTリンパ球のグループは、イオノマイシンで刺激し、12〜48時間、PMAの濃度を増加させます。 2 ngの/ mlの誘導された強固な幼若化反応の両方と有意な増殖という低PMA濃度。このような免疫抑制剤のシクロスポリンA(CSA)、FK506(タクロリムス)、およびラパマイシン(シロリムス)、ならびにイオンチャネル遮断薬のTRAM-34とFTY720のようないくつかの薬剤の効果の測定(fingolimodが)、芽球の増殖に報告された効果と良好な一致を示しました。抗CD3および抗CD28抗体でコーティングした磁気ビーズとPMA /イオノマイシンおよびマウスT細胞刺激に対するヒトPBMCの幼若応答も測定しました。
セルカウンタアッセイは、これらの効果の組み合わせを見て、上記の方法とは異なり、同時に、しかし別々に幼若および増殖速度(細胞密度)の両方を定量化します。提示されたプロトコルは、分裂促進や免疫調節剤の効力を評価するための迅速かつ堅牢な技術を提供します。
ここでは、自動細胞カウンターを用いてT細胞幼若形質転換の迅速な検出および定量するための技術を記載します。我々の条件(250 ngの/ mlのPMAおよびイオノマイシン刺激250 nM)を下に、細胞の表面積は活性化の48時間後に2倍とボリューム3倍に増加しました。アッセイは、細胞体積は( 図2D)を安静時と比較して、唯一の1.25倍に増加した活性化の最初の12時間、中に爆破を検出するのに十分な感度です。抗CD3および抗CD28抗体でコーティングした磁気ビーズを使用してT細胞活性化のより生理学的に関連する機構は、体積平均2.3倍の増加(活性化後72時間で、 図3D)との有意な幼若応答を生じました。ヒト単核細胞を48時間( 図4)のためのPMAの際に体積の2.6倍の変化/刺激イオノマイシンを示しました。 ICRマウス脾臓T細胞の平均直径及び体積があると決定されましたそれぞれ6.9ミクロンと1.9×10 -4 NL、。 (1健康なドナーからの)ヒトPBMCは、7.7ミクロンと2.7×10 -4 NLの平均体積の平均直径を有していました。このプロトコルを使用して、我々はまた、T細胞を活性化する能力について、PMAの濃度を増加させる試験しました。これらの単セルの結果は、同様のPMA濃度で行わ増殖アッセイと一致していました。
細胞増殖に影響を与えることが報告され、いくつかの化合物を試験した:FTY720 31,32。免疫抑制剤のシクロスポリンA、FK506、及び27,28ラパマイシン ;そして、TRAM-34、カルシウム活性化KCa3.1チャネル33,35のブロッカー。私たちは、試験した濃度で、幼若化の最も強力な阻害剤は、CsAおよびFK506た、ことがわかりました。ラパマイシンは、幼若に小さいが統計的に有意な抑制効果を持っていました。 TRAM-34は、他の一方で、幼若化に影響を及ぼしませんでした。
シクロスポリンは、幼若およびpの両方を抑制しました自動細胞カウンター測定は、T細胞増殖における薬物の効率の良い相関であることを実証roliferationはなく、完全に( 図2Bおよび2C)。シクロスポリンと一緒にラパマイシンの存在下では、幼若はNFAT-との組み合わせにおけるmTOR媒介経路が完全にPMA /イオノマイシン( 図3C)との分裂促進刺激によってT細胞の拡大を考慮することができることを示唆している、完全に阻害されました。
いくつかの増殖アッセイのダイナミックレンジ( 図2参照 )に制限されます。そのような私たちが使用している1( 図2C)、アポトーシスおよび壊死細胞からの寄与を含む信号を報告として増殖アッセイ、。測定は唯一の生存細胞に関する限り自動化された直径の変化の測定は、その制限はありません。細胞生存率は、健康な、生細胞からトリパンブルー染色排除によって評価されます。サイズ測定では、前方に使用してダブレットセル差別フローサイトメトリーでの光の散乱は22問題となる可能性があります。自動細胞カウンターの測定では、いかなる二重集団は( 図1)は見られませんでした。また、測定は、100と200 nmのシクロスポリン( 表1)及びマイトジェン刺激の12時間( 図2D)内幼若検出するための効果を区別するのに十分に正確でした。
この新しいアッセイは、サンプル数が少ないために特に有用です。最大15サンプルを1時間で測定することができます。しかし、このアッセイを軽減することができるほとんどがその限界を有します。それが効果的にセル径の小さい(<1μm)の違いを解決することができるにもかかわらず、我々が使用される機械のモデルは、5ミクロンの低い検出閾値を持っています。それが効果的に小さい直径を有するすべてのセルを除外するので、この制限は、非常に小さなセルサイズの過大評価を引き起こす可能性があります。しかし、細胞カウンタの新しいモデルは、検出THRESHを有しますこの問題を軽減する必要があります〜2μmの歳、。試料中にあまりにも多くの破片がある場合は、機器は、生細胞として扱います。また、気泡が時折フローセルに入ると、マシンによって捕捉された細胞画像の歪みを引き起こす可能性があります。歪みは、生存能力の決意に影響を与えるようには見えないが、それは、測定された直径に影響を与えることができます。したがって、各試験からのデータを分析のために受け入れられる前に、すべてのイメージが気泡のための実験によって確認することをお勧めします。ソフトウェアのみの細胞の周りに円を描くので、非球形細胞の直径は、非球形の細胞を検定はあまり適して、長軸に偏ってもよいです。
このアッセイは、数時間を必要とする増殖アッセイと比較して、サンプル当たり約4分を取って、迅速です。データ収集は、デバイスに付属のソフトウェアを使用しても、かなり単純です。ソフトウェアは、SPに測定データをエクスポートすることができます分析のためreadsheet。最後に、人口、測定とは対照的に、単一のセルです。幼若および増殖の両方が測定されます。そして、それは同時に、生存細胞と死細胞を区別します。免疫応答を開始する能力のために、様々なマウス系統を評価するために使用することができます。アッセイはまた、ヒトのドナーからのT細胞における芽球の測定( 図4)のために首尾よく使用することができ、それは他の細胞型においても使用することができます。
細胞容積の増加は、代謝の調節に寄与することが知られている:細胞膨張は、肝細胞36,37にグルタミン誘発性グリコーゲン合成および脂質生成を刺激します。走化性エージェントが38-40膨潤 10〜15パーセントを誘導しながら、好中球は、35から60パーセントの移行に関連するボリュームの増加が表示されます。現在のアッセイは、潜在的に、これらのプロセスを研究するために使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |