Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
제브라 피쉬 배아 인해 접근성과 광 투과성의 용이성 복잡한 형태 형성 과정을 연구 할 수있는 이상적인 실험 시스템을 제공합니다. 특히, 후방 본체 신도 여러 조직 변형 몸 축의 큰 부분의 형성을 유도하기 위해 함께 작용하는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 장기간 시간 경과 화상이 과정을 관찰하기 위해 충분한 지원 현미경 및 취득을 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지할 수있게 장착 기술을 활용하는 것이 필요하다. 또한, 장착은 정상적인 발달에 영향을주지 않고 후방 바디 영역의 생장에 대한 충분한 이동 자유를 제공한다. 마지막으로, 다양한 영상 셋업에 영상을 수 있도록 장착 방법의 다양성에 어느 정도가 있어야합니다. 여기서, 우리는 후방 바디 elongatio 개발을 이미징 실장 기술을 제시n은 제브라 피쉬 D. 레 리오한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서, 헤드 및 난황 낭 영역이 거의 아가에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 우리는이 똑바로 반전 및 수직 빛 시트 현미경 셋업에 대해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 후방 몸 이미징을위한 배아를 장착에 초점을 맞추고 있지만, 쉽게 제브라 피쉬 개발의 여러 측면의 라이브 영상에 대해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
후방 바디 신장 배아 몸 축 큰 부분을 형성하기 위해 연장되는 배아 발달에 필수적인 과정이다. 이는 다중 셀 동작 개별 조직의 형태 형성 수준을 생성하는 역할을 배위하는 복잡한 형태 형성 공정의 일례이다. 이러한 차동 조직 변형은 전체 구조 수준에서 후방 본체의 신장을 생성하도록 함께 작용한다. 이러한 프로세스 제어 및 개발 과정에서 조정하는 방법을 이해하려면, 우리는 (분자, 세포, 세포 집단과 조직의 수준에서 즉) 여러 규모에서 이러한 프로세스를 수행 할 수 있어야하고, 전체 구조의 형태 형성에 직접 연관에 .
자신의 광학 투명성과 작은 크기는 최소 침습 광 이미징의 응용 프로그램에 대해 허용하는 제브라 피쉬 배아는 거실에 적합 접근 이미징 후방 신체 신장에 이상적입니다전자 영상. 한 이것은 분자 레벨에서 후방 본체 개발을 밝혀왔다 최근 공보의 시리즈에 의해 입증 된 2 단 전지 4뿐만 아니라 세포 집단 및 전체 기관의 수준에서 3 간 조직 행동. (5)
이러한 공 초점, 다 광자 현미경 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)와 같은 고급 이미징 기술은 광 독성 광 표백 효과의 감소와 개발 프로세스의 장기 영상을 가능하게한다. 실제 샘플의 장착을위한 견고한 방법이 세 가지 목표를 달성하기 위해 필요하다 : 1) 충분한지지가 현미경 및 수집 동안 전송하는 동안 올바른 방향으로 샘플을 유지하기 위해, 2) 샘플의 이동 충분한 자유의 생장을 허용하는 정상 (STABLE)에 영향을주지 않고 후방 바디 영역opment, 그리고 마지막으로 3) 장착 방법의 다양성에 어느 정도의 다양한 영상 셋업에 영상을 허용합니다.
이 프로토콜은 제브라 D. 레 리오의 개발을 이미징 실장 기술을 소개한다. 이 기술은 일반적으로 신장 및 개발 후방 바디 영역을 남기면서 머리와 난황 낭 영역이 거의 아가 로스에 포함되도록 배아 장착 포함한다. 이와 같이,도 아가 표준 광 이미징 기술에 의해 촬상 가능으로 현상 신체의 다른 영역의 장기 촬상에 적합한 방법이다. 이 바꾸는 방향에서 배아를 탑재하는 것도 가능하지만,이 프로토콜은, 횡 방향으로 배아의 장착을 보여줍니다. 그것은 또한, 수직 반전 및 수직 빛 시트 현미경 설정하는 방법을 적용하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실장 기술은 배아가 현미경 및 여러 길이 스케일에서 후방 신체 신장을 다음 목표로 이상 장기 시간 경과 이미징 실험에 전송하는 동안 계속 유지 될 수 있습니다. 이 모두 수직 및 반전 현미경 셋업에서 촬상이 가능하고,이 제안은 상기 수직 배향 SPIM에 적응 될 수있는 방법에 대해 이루어지는 것을 또한, 다목적.
이 프로토콜의 중요한 단계는이 구조의 정상적인 개발을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
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