Summary

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Published: January 26, 2017
doi:

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

embrioni di zebrafish offrono un sistema sperimentale ideale per studiare processi morfogenetici complessi a causa della loro facilità di accessibilità e trasparenza ottica. In particolare, l'allungamento del corpo posteriore è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui più deformazioni tissutali agiscono insieme per dirigere la formazione di una grande parte dell'asse corpo. Per osservare questo processo time-lapse imaging a lungo termine è necessario utilizzare una tecnica di montaggio che consente il supporto sufficiente a mantenere campioni nell'orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e acquisizione. Inoltre, il montaggio deve anche fornire sufficiente libertà di movimento per la conseguenza della regione di corpo posteriore senza alterarne il normale sviluppo. Infine, ci deve essere un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Qui vi presentiamo una tecnica di montaggio per l'imaging lo sviluppo di posteriori elongatio corpon nel zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni tale che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio montaggio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Vi mostreremo come questo possa essere adattato per posizione verticale, capovolta e verticale luce fogli microscopia set-up. Anche se questo protocollo si concentra su embrioni per l'imaging per il corpo posteriori di montaggio, potrebbe facilmente essere adattato per l'imaging dal vivo di molteplici aspetti dello sviluppo zebrafish.

Introduction

Posteriore allungamento corpo è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui l'embrione si estende per formare una grande parte dell'asse corpo. Si tratta di un esempio di un complesso processo morfogenetico da cui comportamenti delle cellule multiple agire coordinatamente per generare la morfogenesi a livello dei singoli tessuti. Queste deformazioni tissutali differenziale quindi agiscono insieme per generare l'allungamento del corpo posteriore, a tutto il livello della struttura. Per capire come questi processi sono controllati e coordinati durante lo sviluppo, dobbiamo essere in grado di seguire questi processi a scale multiple (cioè a livello di molecole, cellule, le popolazioni di cellule e tessuti) e di mettere in relazione questo direttamente alla morfogenesi di tutta la struttura .

zebrafish embrioni sono ideali per l'imaging posteriore allungamento corpo come la trasparenza ottica e piccole dimensioni permette l'applicazione di immagini poco minimamente invasiva approcci adatta a live imaging. 1 Ciò è stato evidenziato da una serie di recenti pubblicazioni che hanno fatto luce sullo sviluppo del corpo posteriore a livello di molecole, 2 singole cellule, 3 e inter-tessuto comportamenti, 4 nonché a livello della popolazione cellulare e tutto l'organo. 5

tecniche di imaging avanzate come confocale, microscopia multi-fotone e piano selettivo illuminazione microscopia (SPIM) stanno permettendo la formazione immagine a lungo termine dei processi di sviluppo, con effetto di tossicità luce e fotometabolismo diminuito. tecniche robuste per il montaggio di campioni vivi sono necessari per raggiungere tre obiettivi: 1) sostegno sufficiente per mantenere campioni nell'orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e durante l'acquisizione, 2) sufficiente libertà di movimento del campione per consentire la conseguenza di la regione di corpo posteriore senza compromettere la sua normale develluppo, e infine 3) un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up.

Questo protocollo introduce una tecnica di montaggio per l'imaging lo sviluppo del zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni montaggio in modo che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Come tale, è anche un metodo appropriato per imaging a lungo termine delle altre regioni del corpo di sviluppo come l'agarosio permette l'imaging mediante tecniche di imaging luce standard. Questo protocollo dimostra montaggio di embrioni in un orientamento laterale, anche se è possibile montare embrioni in orientamenti alterative. Sarà inoltre mostrerà come adattare il metodo per configurazioni microscopia ottica fogli verticali, invertiti e verticali.

Protocol

1. preparazione di soluzioni e tirato Vetro ago Fare una soluzione 25x magazzino di Tricaine (3-amino acido benzoico etil estere, chiamato anche etil 3-aminobenzoate) a 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8.8 e portare questa soluzione è a pH 7. aliquota del 4 ml e conservare a -20 ° C. NOTA: L'anestetico Tricaine agisce preferenzialmente sui canali del sodio voltaggio-dipendenti neurali bloccando così contrazioni muscolari e il movimento 6. Effettuare una soluzione di l…

Representative Results

Il protocollo descritto sopra dettagli una tecnica versatile per il montaggio di embrioni di zebrafish per l'imaging lasso di tempo a lungo termine. Un esempio di questo è mostrato in Figura 2A e animato / video Figura 1. Gli embrioni sono stati iniettati nella fase 1 cella con mRNA codificante la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR. Nella fase 15 somite sono stati montati come descritto sopra e ripreso per 12 ore su un microscopio confo…

Discussion

Questa tecnica di montaggio consente di embrioni da tenere ancora durante il trasferimento al microscopio e oltre esperimenti di imaging time-lapse a lungo termine volti a seguito posteriore allungamento del corpo a più scale di lunghezza. Inoltre, è versatile in quanto consente per l'esposizione su entrambi microscopia verticale e capovolto set-up, e un suggerimento è fatto per come questo può essere ulteriormente adattata per SPIM orientato verticalmente.

Un passo fondamentale in q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes Mattek P35-1.5-10-C 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles  Sutter  BF 120-94-10 We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel Feather P-715 Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes 230 mm long
REAGENTS
Tricaine Sigma-Aldrich A5040
Low-melting point agarose Sigma-Aldrich A9414
EQUIPMENT
Fine forceps  FINE SCIENCE TOOLS GMBH  11252-30  Dumont #5
Needle puller  Sutter  P97 Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope Leica S8 Apo

References

  1. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
  2. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  3. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  4. Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
  5. Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
  6. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
  7. Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  8. Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
  9. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
  10. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).

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Cite This Article
Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (119), e55210, doi:10.3791/55210 (2017).

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