Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
Эмбрионы рыбок данио предлагают идеальную экспериментальную систему для изучения сложных морфогенетических процессов из-за легкости их доступности и оптической прозрачности. В частности, удлинение задний корпус является важным процессом эмбрионального развития, с помощью которых множественные деформации ткани действуют вместе, чтобы направлять формирование значительной части оси тела. Для того чтобы наблюдать этот процесс долгосрочного покадровой обработки изображений необходимо использовать монтажную технику, которая позволяет достаточную поддержку, чтобы сохранить образцы в правильной ориентации во время передачи в микроскоп и приобретения. Кроме того, крепление должно также обеспечить достаточную свободу движения для разрастания области тела заднего, не влияя на его нормальное развитие. Наконец, должна быть определенная степень в универсальности метода монтажа, чтобы позволить визуализацию на различных изображений наборах. Здесь мы представляем монтажную технику для визуализации развития заднего elongatio телап в данио D. rerio. Этот метод включает в себя монтаж эмбрионов таким образом, что участки головы и желтка почти полностью включены в агарозы, оставляя вне области тела задней удлиняется и нормально развиваться. Мы покажем , как это может быть адаптирована для вертикально, перевернутый и вертикальной световой микроскопии листа Наладки. Хотя этот протокол фокусируется на монтаже эмбрионов для визуализации для заднего тела, она легко может быть адаптирована для живого изображения нескольких аспектов данио развития.
Introduction
Задней тела удлинение является важным процессом в эмбриональном развитии, с помощью которого эмбрион простирается, чтобы сформировать большую часть оси тела. Это является примером сложного морфогенетического процесса, с помощью которого несколько поведение ячеек действуют скоординировано для генерации морфогенез на уровне отдельных тканей. Эти деформации дифференциальной ткани затем действовать вместе, чтобы сформировать удлинение заднего тела на уровне целого структуры. Для того, чтобы понять , каким образом контролируются и координируются в процессе развития этих процессов, мы должны быть в состоянии следовать за этими процессами в различных масштабах (т.е. на уровне молекул, клеток, популяций и клеточные ткани) и связать это непосредственно к морфогенеза всей структуры ,
Эмбрионы рыбок данио идеально подходят для формирования изображения заднего удлинения тела, как их оптическая прозрачность и малый размер позволяет для применения минимально инвазивной визуализации света подходы хорошо подходят для Livэлектронной визуализации. 1 Об этом свидетельствует ряд недавних публикаций , которые пролили свет на развитие заднего тела на уровне молекул, 2 отдельные клетки, 3 и между тканевые поведения, 4, а также на уровне популяции клеток и целого органа. 5
Передовые методы визуализации, такие как конфокальной, многофотонной микроскопии и селективной плоскости освещения микроскопии (SPIM) включаете долгосрочную визуализацию процессов развития со снижением эффекта легкой токсичности и фото-отбелки. Надежные методы для монтажа живых образцов необходимы для достижения трех целей: 1) достаточной поддержки для сохранения образцов в правильной ориентации во время передачи в микроскоп и во время приобретения, 2) достаточная свобода передвижения образца, чтобы для вырост область задней тела, не затрагивая его нормальную Develвитие, и, наконец, 3) в определенной степени в универсальности метода монтажа, чтобы обеспечить визуализацию на различных изображений наборах.
Этот протокол вводит монтажный метод для получения изображения на развитие данио Д. rerio. Этот метод включает в себя монтаж эмбрионов таким образом, что участки головы и желтка почти полностью включены в агарозы, оставляя область тела заднюю удлиняется и нормально развиваться. Таким образом, он также является подходящим методом для долгосрочной визуализации других регионов развивающегося тела, как агароза позволяет визуализации с помощью стандартных методов визуализации света. Этот протокол демонстрирует монтаж эмбрионов в боковой ориентации, хотя также можно монтировать эмбрионов в альтеративного ориентаций. Она будет и далее показано, как адаптировать метод вертикально, перевернутых и вертикальных световых листов микроскопии установок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта монтажная техника позволяет эмбрионы должны храниться до сих пор в процессе передачи на микроскоп и более долгосрочных экспериментов покадровой обработки изображений, направленных на следующие заднего удлинения тела в различных масштабах длины. Кроме того, он является универсал…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
