Summary

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Published: January 26, 2017
doi:

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen – Mikroskopie – Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.

Introduction

Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der Ebene von Molekülen, Zellen, Zellpopulationen und Gewebe) , und dieses an die Morphogenese der gesamten Struktur direkt zu beziehen .

Zebrabärbling-Embryonen sind für die Bildgebung hintere Körperdehnung ideal als ihre optische Transparenz und die geringe Größe ermöglicht die Anwendung der minimal-invasiven Bildgebung Licht nähert sich gut für Live-Bildgebung. 1 Dieses wurde durch eine Reihe neuerer Publikationen belegt worden , die Licht auf hintere Körperentwicklung auf der Ebene von Molekülen vergossen haben, 2 Einzelzellen, 3 und inter Gewebe Verhaltensweisen, 4 sowie auf der Ebene der Zellpopulation und ganze Organ. 5

Advanced Imaging-Techniken wie konfokale Multiphotonenmikroskopie und selektive Ebene Beleuchtung Mikroskopie (SPIM) ermöglichen die langfristige Darstellung von Entwicklungsprozessen mit einer verminderten Wirkung von Licht Toxizität und Photobleaching. Robusten Techniken für die Montage von lebenden Proben benötigt werden drei Ziele zu erreichen: 1) eine ausreichende Unterstützung für das Mikroskop während der Übertragung Proben in der richtigen Ausrichtung zu halten und während der Aufnahme, 2) eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Probe für das Auswachsen zu ermöglichen von der hintere Körperbereich ohne seine normale Entwick beeinflussenwicklung und schließlich 3) ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montageverfahrens Bildgebung auf verschiedenen Imaging-Setups zu ermöglichen.

Dieses Protokoll stellt eine Montagetechnik zum Abbilden der Entwicklung der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen so dass der Kopf und yolk sac Regionen fast vollständig in Agarose enthalten, während Verlassen der posterior Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Als solches ist es auch ein geeignetes Verfahren für die Langzeit-Bildgebung von anderen Regionen des Entwicklungs Körper als die Agarose Bildgebung durch Standardlichtabbildungstechniken ermöglicht. Dieses Protokoll veranschaulicht in einer seitlichen Ausrichtung von Embryonen Befestigungs, obwohl es auch möglich ist, Embryonen in alternativen Orientierungen zu montieren. Es wird weiter zeigen, wie das Verfahren zur aufrechten, umgedreht und vertikale Lichtbogen-Mikroskopie-Setups anzupassen.

Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Pulled Glasnadel Machen Sie eine 25x Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, die auch als Ethyl-3-aminobenzoat) bei 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8,8 und bringen diese Lösung bei pH 7. Aliquot von 4 ml und an einem -20 ° C. HINWEIS: Das Anästhetikum Tricaine wirkt bevorzugt auf neuronalen spannungsgesteuerten Natriumkanäle dadurch blockiert Muskelzuckungen und Bewegung 6. Machen Sie eine Arbeitslösung von Tricaine b…

Representative Results

Das Protokoll oben skizzierte Details eine vielseitige Technik zur Montage von Genaktivität für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung. Ein Beispiel hierfür ist in 2A und in animierter / Video – 1 gezeigt. Die Embryonen wurden in der 1-Zell-Stadium injiziert mit mRNA, die das Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein kikumeGR kodiert. Am 15 Somiten Stadium wurden sie wie oben beschrieben montiert und für 12 h auf einem invertierten konfokalen Mikrosko…

Discussion

Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden.

Ein entscheidender Schritt …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes Mattek P35-1.5-10-C 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles  Sutter  BF 120-94-10 We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel Feather P-715 Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes 230 mm long
REAGENTS
Tricaine Sigma-Aldrich A5040
Low-melting point agarose Sigma-Aldrich A9414
EQUIPMENT
Fine forceps  FINE SCIENCE TOOLS GMBH  11252-30  Dumont #5
Needle puller  Sutter  P97 Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope Leica S8 Apo

References

  1. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
  2. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  3. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  4. Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
  5. Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
  6. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
  7. Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  8. Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
  9. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
  10. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Play Video

Cite This Article
Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (119), e55210, doi:10.3791/55210 (2017).

View Video