Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) se definen como englobando células de vástago embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) y tiene la capacidad única no sólo en auto renovación bajo condiciones de crecimiento apropiado, pero también, la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares derivados de las tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo¹. Debido a estas habilidades, hPSCs sostener la gran promesa para la medicina regenerativa, modelado de enfermedades y terapias basadas en células². Mientras que varios tipos de células se han diferenciado con éxito de hPSCs, un desafío importante es la especificación en vitro de adulto hPSC-derivó las células madre hematopoyéticas (HSCs) y progenitores hematopoyéticos definitivos.

Una probable barrera para el desarrollo de HSCs humanas de hPSCs es la presencia de múltiples programas hematopoyéticas en el embrión humano³. El primer programa que emerge, denomina “hematopoyesis primitiva”, se origina dentro del tejido del saco vitelino extraembrionarias y mejor se caracteriza por su producción transitoria de progenitores erythroblast (EryP-CFC), macrófagos y megacariocitos. En particular, este programa no da lugar a las HSCs, ni da lugar a progenitores linfoides T y B. Sin embargo, el saco vitelino transitorio dan lugar a progenitores hematopoyéticos definitivas restringidos, como el progenitor mieloide Eritro (EMP^4,5,6,7,8) y la eritroide deficiente linfoide cebada multipotent progenitora (LMPP⁹). Sin embargo, EMPs ni LMPPs son completamente multipotentes, o capaz de engraftment HSC-como en recipientes adultos. En cambio, más adelante en el desarrollo, el programa hematopoyético “definitivo” clásicamente definido se especifica en la región aorta-gónada-mesonefros del embrión adecuado, dando lugar a todos los linajes hematopoyéticos adultos, incluyendo el HSC. La especificación de estas células hematopoyéticas definitivas intra embrionarias ocurre de manera dependiente de la muesca, a través de una transición endotelial hematopoyético de hemogenic endotelio (él)^{3,10,11 ,12,13,14}. Además de capacidad de reconstitución, el potencial del multilineage y muesca-dependencia de estas células pueden utilizarse para distinguir estos progenitores hematopoyéticos definitivos de la EMP y LMPP (revisado en las referencias^3,13 ).

Comprender los mecanismos de especificación hematopoyética primitiva y definitiva de hPSCs es probablemente esencial para la producción reproducible de progenitores hematopoyéticos definitivos a través de una variedad de líneas hPSC. Hasta hace poco, hPSC protocolos de diferenciación que podrían separar multipotentes definitivos y primitivos progenitores hematopoyéticos no existían^{15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25}. Muchos enfoques con suero bovino fetal (FBS) y/o co-cultivo stromal en primer lugar describe el potencial hematopoyético de hPSC diferenciación, con mezclas de primitivo y definitiva hematopoyética potencial^{15,16, 17,19,22,23,25}. Además, muchos protocolos sin suero hematopoyéticos han descrito los requisitos de señal para la especificación del mesodermo del hPSCs que alberga hematopoyética potencial^{18,20,21, 24}. sin embargo, como estos métodos todavía dieron lugar a mezclas heterogéneas de ambos programas, su uso en aplicaciones clínicas y mecanismos del desarrollo de la comprensión puede ser limitada.

Recientemente hemos construido en estos estudios, después de haber descrito los requisitos de señal de la fase específica de ACTIVIN NODAL y WNT de señalización en la especificación hematopoyética primitiva y definitiva del mesodermo derivado hPSC^18,26 . El último era particularmente único, como el uso de la manipulación de señales WNT fase específica permite la especificación de exclusivamente primitivo o exclusivamente de progenitores hematopoyéticos definitiva²⁶. Durante la especificación del mesodermo, la inhibición de la señalización de WNT canónico con el inhibidor PORCN IWP2 resultados en la especificación de CD43⁺ EryP-CFC y progenitores mieloides, con ningún potencial linfoide detectable. En contraste, estimulación de canónica WNT de señalización con el inhibidor de la GSK3β, CHIR99021, durante la misma etapa de diferenciación dio lugar a la ausencia completa de CD43 detectable⁺ EryP-CFC, mientras que al mismo tiempo conduce a la Especificación de CD34⁺CD43⁻ . Esta población poseía mieloide, HBG-expresando eritroides y linfoides T potencial. Posteriores análisis identificaron esto como falta de la expresión de su potencial hematopoyético, CD73^27,28 y CD184²⁸fue dependiente de la muesca²⁸. Además, sola célula clonales análisis demostraron que estos linajes hematopoyéticos definitivos se pudieran derivar de las células multipotentes²⁸. Tomados juntos, estos estudios indican que etapa específica WNT signaling manipulación puede especificar puros primitivos progenitores hematopoyéticos o multipotentes dependiente de la muesca definitiva de progenitores hematopoyéticos.

Aquí describiremos nuestra estrategia de diferenciación que los rendimientos de progenitores hematopoyéticos exclusivamente primitivo o definitivos, través de la manipulación de la canónica WNT de señalización durante mesodérmico modelando y su linaje hematopoyético posterior ensayos. Este protocolo es de gran valor para los investigadores que están interesados en la producción de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivas de hPSCs para aplicaciones de la medicina regenerativa.