Summary

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

Abstract

אחת ממטרותיה העיקריות עבור רפואה רגנרטיבית היא הדור ואת התחזוקה של תאי גזע hematopoietic (HSCs) נגזר מתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). עד לאחרונה, יש מאמצים כדי להתמיין hPSCs HSCs שנוצר בעיקר אבות hematopoietic כי חוסר HSC פוטנציאל, ומזכירים במקום שק החלמון hematopoiesis. אלה אבות hematopoietic המתקבלת תהיה מוגבלת השירות עבור במבחנה מידול המחלה של מבוגרים hematopoietic הפרעות שונות, בעיקר אלו של שושלות הלימפה. עם זאת, לאחרונה תארנו שיטות לייצר erythro-myelo-הלימפה multilineage אבות hematopoietic סופית hPSCs באמצעות פרוטוקול התמיינות מכוונת בשלב הספציפי, בו אנחנו כאן. דרך הדיסוציאציה אנזימטי של hPSCs על קרום המרתף מצופים מטריצה plasticware, embryoid הגופות (EBs) נוצרות. EBs מובדלים כדי והמזודרם באמצעות recombinant BMP4, אשר לאחר מכן שצוין לתוכנית hematopoietic סופית על ידי מעכב GSK3β, CHIR99021. לחלופין, hematopoiesis פרימיטיבית צוין על ידי מעכב PORCN, IWP2. Hematopoiesis הוא מונע נוסף באמצעות תוספת של רקומביננטי VEGF וציטוקינים hematopoietic תומכת. המוצא לאגס hematopoietic וכתוצאה מכך שנוצר בשיטה זו יש פוטנציאל לשמש המחלה ומודלים התפתחותית, חוץ גופית בתוך.

Introduction

תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) מוגדרים המקיף תאי גזע עובריים (hESCs) והן אנושית המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), יש את היכולת הייחודית של לא רק בתהליך התחדשות עצמית תחת תנאי הגידול המתאימים, אבל גם היכולת להתמיין לכל סוגי תאים שמקורם שלושת הרבדים נבט: האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם1. בשל יכולות ייחודיות אלה, hPSCs החזק הבטחה גדולה עבור רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה, טיפולים מבוססי תא2. בעוד סוגי תאים מרובים יש כבר בהצלחה תריז hPSCs, אתגר משמעותי אחד הוא המפרט במבחנה של אך ורק למבוגרים כמו נגזר hPSC hematopoietic תאי גזע (HSCs), אבות hematopoietic סופית.

אחד סביר מכשול להתפתחות של האדם HSCs מן hPSCs היא הנוכחות של תוכניות hematopoietic מרובות בתוך העובר3. בתוכנית הראשונה שעלתה, כינה “hematopoiesis פרימיטיבית,” מקורו בתוך רקמת extraembryonic שק חלמון, מאופיין בצורה הטובה ביותר שלה ארעי ייצור אבות erythroblast (EryP-CFC), מקרופאגים, megakaryocytes. ראוי לציין, תוכנית זו אינה מעניקה עלייתו HSCs, וגם זה נותן עלייה אבות הלימפה T ו- B. עם זאת, שק החלמון transiently להצמיח אבות hematopoietic סופית מוגבלת, כגון erythro-מיאלואידית המייצר (EMP4,5,6,7,8) erythroid לקויה הלימפה בשלה multipotent המייצר (LMPP9). אולם, פעימה וגם LMPPs הם multipotent באופן מלא, או מסוגל כמו HSC engraftment ב נמענים למבוגרים. לעומת זאת, מאוחר יותר בהתפתחות, התוכנית בסגנון קלאסי מוגדר hematopoietic “סופית” צוין באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros של העובר תקין, והוליד כל שושלות hematopoietic למבוגרים, כולל את מועדון הכדורגל מונפלייה. המפרט של תאים אינטרה-עובריים אלה hematopoietic סופית מתרחשת באופן תלוי-חריץ, דרך המעבר אנדותל-אל-hematopoietic hemogenic אנדותל (הוא)3,10,11 ,12,13,14. מלבד יכולת שיחזור, multilineage פוטנציאליים חריץ-התלות של תאים אלה ניתן להשתמש כדי להבחין בין אלה אבות hematopoietic מוחלטת מן השדה האלקטרומגנטי של LMPP (נבדקה הפניות3,13 ).

הבנת את mechanism(s) המסדירים פרימיטיביים ומוחלטת מפרט hematopoietic מ- hPSCs סביר קריטי לייצור לשחזור של אבות hematopoietic סופית על פני מגוון רחב של קווי hPSC. עד לאחרונה, פרוטוקולים של בידול hPSC יכול להפריד אבות hematopoietic multipotent פרימיטיבית ומוחלטת לא היה קיים15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. גישות רבות שימוש בסרום שור עוברית (FBS) ו/או תרבות משותפת סטרומה תחילה בקווים כלליים את הפוטנציאל hematopoietic של בידול hPSC, עם תערובות של פרימיטיביים ומוחלטת hematopoietic פוטנציאליים15,16, 17,19,22,23,25. זה עוד רחוק, פרוטוקולים ללא סרום hematopoietic רבים תיארו את האות דרישות המפרט של והמזודרם של hPSCs זה בנמלים hematopoietic פוטנציאליים18,20,21, 24. עם זאת, כמו שיטות אלה עדיין הולידה תערובות הטרוגניות של שתי התוכניות, השימוש בהם במסגרת מנגנוני התפתחות ההבנה ויישומים קליניים עלולה להיות מוגבלת.

לאחרונה בנינו על מחקרים אלה, נתקל בקווים כלליים את דרישות ספציפיות שלב אות עבור ACTIVIN/NODAL והאיתות ונ ט במפרט hematopoietic פרימיטיבית ומוחלטת מ נגזר hPSC והמזודרם18,26 . האחרון היה ייחודי במיוחד, בזכות השימוש הספציפי הבמה ונ ט אות מניפולציה מאפשר עבור המפרט באופן בלעדי פרימיטיבי או באופן בלעדי סופית אבות hematopoietic26. במהלך והמזודרם מפרט, עיכוב של חגיגת הקנוני איתות עם החומר המדכא PORCN IWP2 תוצאות במפרט של CD43+ EryP-CFC ואת אבות מיאלואידית, עם פוטנציאל הלימפה לזיהוי. בניגוד חריף, גירוי של קנוניקל ונ ט איתות עם החומר המדכא GSK3β, CHIR99021, בשלב זהה של בידול, גרמו העדר מוחלט של CD43 לזיהוי+ EryP-CFC, בזמן בו זמנית שהוביל אל מפרט של CD34+CD43 הוא. אוכלוסייה זו דיבוק מיאלואידית, HBG-ביטוי erythroid, ואת הפוטנציאל T-הלימפה. ניתוחים לאחר מכן זיהה זה הוא כמו חסר ההבעה של27,CD7328 , CD18428, הפוטנציאל hematopoietic היה תלוי חריץ-28. ניתוחים נוספים, תא בודד המשובטים הוכיח כי אלה שושלות hematopoietic סופי יכול להיגזר תאים בודדים multipotent28. יחדיו, מחקרים אלה מציינים כי שלב ספציפי ונ ט איתות מניפולציה ניתן לציין טהור פרימיטיביים אבות hematopoietic, או multipotent תלויי-דרגה סופית hematopoietic אבות.

כאן, אנחנו חלוקה לרמות אסטרטגיית הבידול שלנו המניבה אבות hematopoietic באופן בלעדי פרימיטיבי או סופי, באמצעות מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות במהלך המתבנת mesodermal, השושלת hematopoietic במורד הזרם שלהם מבחני. פרוטוקול זה הוא בעל ערך רב לחוקרים המעוניינים בייצור של אבות hematopoietic פרימיטיבי או מוחלטת של hPSCs עבור רפואה רגנרטיבית יישומים.

Protocol

1. ריאגנטים משתית OP9-DL4 קבל תא קווים; hESCs או hiPSCs 1, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) 29, 30 , 31. הכנה ריאגנט להכין פתרון w/v 0.1% של ג’לטין ב- PBS. לחטא מאת autoclaving ולאחסן ב 4 ° C לאחר aliquoting. להכין plasticware מצופים ג’לטין. המעיל. ובכ…

Representative Results

שרטוט המתאר את אינדוקציה של פרימיטיביים ומוחלטת אבות hematopoietic מן hPSCs מודגם באיור1. והמזודרם תכנים על ידי קנוניקל ונ ט איתות מתרחשת בימים 2-3 של בידול, ואחריו קדמון hematopoietic מפרט. ניתוח cytometric תזרים נציג והמושבה ויוצרים מבחני methy…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה, ללא סרום, נטולת משתית הבידול של אבות hematopoietic פרימיטיבי או סופית. מפרט mesodermal של אבות hematopoietic פרימיטיבי או סופית תושג באופן אמין באמצעות פרוטוקול שלנו, המנצלת באופן ייחודי מעכבי מולקולה קטנה של איתות ונ ט הקנוני. ההפעלה ונ ט בשלב הספציפי על ידי החומר המדכא GSK3β CHIR9902…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו בתמיכתם של המחלקה לרפואה פנימית, המחלקה להמטולוגיה, באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה. תקליטור נתמכה על ידי T32HL007088 מן הלאומי ללב, ריאות, מכון דם. CMS נתמכה על ידי האגודה האמריקאית של המטולוגיה מלומד בפרס.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Play Video

Cite This Article
Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

View Video