Summary

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

Здесь мы представляем человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) культуры протоколы, используемые для различения hPSCs в CD34+ кроветворные прародителями. Этот метод использует стадии конкретных манипуляции канонических WNT, сигнализации для указания клетки исключительно для окончательного или примитивных гемопоэтических программы.

Abstract

Одна из основных целей для регенеративной медицины является создание и поддержание гемопоэтических стволовых клеток (СКК) от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). До недавнего времени усилия по дифференциации hPSCs в СКК преимущественно породили гемопоэтических прародителей, которые не имеют потенциал HSC и вместо этого напоминают желточного мешка кроветворения. Эти результирующие гемопоэтических прародителями может ограниченную полезность в vitro болезни моделирования различных взрослых гемопоэтических расстройств, особенно те из лимфоидных линий. Однако мы недавно описал методы для создания Эритрею myelo лимфоидных мультилинейного окончательного гемопоэтических прародителей из hPSCs, используя протокол стадии конкретных направленного дифференцирования, который мы приводим здесь. Посредством ферментативного диссоциации hPSCs на базальной мембраны матрица покрытием пластик образуются embryoid органов (EBs). EBs различаются в мезодермы рекомбинантных BMP4, который впоследствии определяется в программе окончательное гемопоэтических ингибитором GSK3β, CHIR99021. В качестве альтернативы примитивных кроветворения определяется ингибитором PORCN, IWP2. Кроветворения далее управляется через помимо рекомбинантного VEGF и поддерживает кроветворную цитокинов. Результате гемопоэтических прародителями, созданные с помощью этого метода имеют потенциал, чтобы быть использованы для развития моделирование, в пробиркеи болезни.

Introduction

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) определяются как включающие в себя как человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), так и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и имеют уникальную возможность не только проходят самообновления в условиях соответствующего роста, но Кроме того, способность отличать в все типы клеток от трех зародышевых:1энтодермы и мезодермы эктодермы. Из-за этих уникальных способностей hPSCs провести большие перспективы для регенеративной медицины, болезни моделирования и терапии на базе ячеек2. В то время как несколько типов клеток были успешно дифференцированы от hPSCs, одна из существенных проблем является спецификацией в vitro исключительно взрослого как hPSC производные гемопоэтических стволовых клеток (СКК) и окончательное гемопоэтических прародителями.

Скорее всего препятствием для развития человека СКК от hPSCs является наличие нескольких гемопоэтических программ внутри эмбриона человека3. Первая программа, которая возникает, называют «примитивных кроветворения,» происходит в пределах extraembryonic желточный мешок ткани и лучше всего характеризуется его переходных производства erythroblast прародителями (EryP-ХФУ), макрофаги и megakaryocytes. В частности эта программа не приводить к СКК, ни это дает подъем к T и B лимфоидные предшественники. Однако желточного мешка временно привести к ограниченным окончательного гемопоэтических прародителями, например Эритрею миелоидного progenitor (EMP4,5,6,,78) и эритроидные недостаточным лимфоидных загрунтовать Multipotent с прародителем (LMPP9). Однако ни EMPs ни LMPPs полностью Multipotent с, или способных приживления HSC-как взрослых получателей. В противоположность этому позже в процессе развития, классически определенных «окончательное» гемопоэтических программа указана в регионе аорто Гонада мезонефрос эмбриона надлежащего, рождая всех взрослых гемопоэтических линии, включая HSC. Спецификации этих внутри эмбриональных окончательного гемопоэтических клеток происходит в паз-зависит от моды, через эндотелиальные и кроветворная переход от кроветворения эндотелия (он)3,10,11 ,12,,1314. Помимо воссоздания потенциала multilineage потенциал и паз зависимость этих клеток могут использоваться различать эти окончательные гемопоэтических прародителей от Эми и LMPP (Обзор ссылки3,13 ).

Понимание механизма(ов), управляющих примитивных и окончательного гемопоэтических спецификации от hPSCs вероятно, решающее значение для воспроизводимых производства окончательного гемопоэтических прародителями через разнообразные hPSC линии. До недавнего времени, hPSC дифференциация протоколы, разделяющие Multipotent с примитивным и окончательного гемопоэтических предшественники не существует,15,16,17,18 19,20,21,,2223,24,25. Многие подходы, с помощью плода бычьим сывороточным (ФБС) и/или стромы Сопредседатель культуры впервые изложил гемопоэтических потенциал hPSC дифференциации, с смеси примитивных и окончательного гемопоэтических потенциальных15,16, 17,19,22,23,25. Кроме того, многие сыворотки бесплатно гемопоэтических протоколы описал сигнал требования к спецификации мезодермы от hPSCs, который затаивает гемопоэтических потенциальных18,20,21, 24. Однако, поскольку эти методы по-прежнему вызывают гетерогенной смеси обеих программ, их использование в клинических приложений и понимание развития механизмов могут быть ограниченными.

Недавно мы построили на эти исследования, обозначив сигнала стадии конкретных требований для ACTIVIN/NODAL и WNT сигнализации в примитивных и окончательного гемопоэтических спецификации от hPSC производные мезодермы18,26 . Последний был особенно уникальным, как его использование стадии специфичных WNT сигнал манипуляции позволяет для спецификации исключительно примитив или исключительно окончательного гемопоэтических прародителями26. Во время спецификации мезодермы, ингибирование канонических WNT сигнализации с PORCN ингибитор IWP2 приводит к спецификации CD43+ EryP-ХФУ и миелоидного прародителями, не поддающиеся обнаружению лимфоидных потенциал. В противоположность, стимуляции канонических WNT сигнализации с ингибитором GSK3β, CHIR99021, во время той же стадии дифференцировки привело к полное отсутствие обнаружению CD43+ EryP-ХФУ, одновременно ведя к Спецификация CD34+CD43 он. Это население обладает миелоидного, С.Петербург-выражая эритроидные и T-лимфоидных потенциал. Последующий анализ определил это как отсутствие выражение CD7327,28 и CD18428и ее потенциал гемопоэтических был NOTCH-зависимых от28. Кроме того, одноклеточных Клональный анализ показал, что эти окончательные гемопоэтических линии может быть получен из28Multipotent с одной клетки. Взятые вместе, эти исследования показывают, что этап конкретных WNT сигнализации манипуляции можно указать чистой примитивных гемопоэтических прародителями, либо Multipotent с NOTCH-зависит от окончательного гемопоэтических прародителями.

Здесь мы приводим Наша стратегия дифференциации, которая дает исключительно примитивных или окончательного гемопоэтических прародителями, через манипуляции канонических WNT, сигнализации во время mesodermal патронирования и их вниз по течению гемопоэтических линии анализов. Этот протокол имеет большую ценность для исследователей, которые заинтересованы в производстве примитивных или окончательного гемопоэтических прародителей от hPSCs для регенеративной медицины приложений.

Protocol

1. реагенты получить клетки линии; ЭСК или hiPSCs 1, мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) 29, OP9-DL4 стромы 30 , 31. Подготовка реагента приготовляют раствор 0,1% w/v желатина в PBS. Стерилизация автоклавированием и хра?…

Representative Results

Схематическое изображение изображением индукции примитивных и окончательного гемопоэтических прародителей от hPSCs показано на рисунке 1. Мезодерма кучность канонические WNT, сигнализации, происходит во время дней 2-3 дифференциации, следуют спецификаци…

Discussion

Этот протокол описывает метод быстрого, сыворотки, строма бесплатно для дифференциации примитивных или окончательного гемопоэтических прародителями. Mesodermal спецификации примитивных или окончательного гемопоэтических прародителей может достигаться надежно с помощью нашего протоко?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана школы медицины университета Департамента внутренней медицины, отдела гематологии, Вашингтон. CD был поддержан T32HL007088 из национального сердца, легких и крови института. CMS была поддержана американского общества гематологии ученый премии.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

Play Video

Cite This Article
Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

View Video