<em> Ex Vivo</em> שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
אנגיוגנזה, כהגדרתו צמיחה של כלי דם חדשים מכלי קיימים, כרוך לתאי אנדותל, pericytes, ותאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון, ואת התיאום עם כלי הלימפה והעצבים. המולטי-התא, אינטראקציות רבות מערכתיות מחייבות חקירת אנגיוגנזה בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. וכך, בעוד השימוש במודלים תרבית תאים במבחנה סיפקו תובנות מכניסטית, ביקורת נפוצה היא כי הם לא לשחזר את המורכבות הקשורה רשת כלי הדם. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היכולת לערוך השוואות זמן לשגות של רשתות כלי הדם ללא פגע לפני ואחרי גירוי אנגיוגנזה ברקמות לפדר עכברוש תרבותי. רקמות בתרבית מכילות רשתות כלי דם מקיים ההיררכיה שלהם. תיוג immunohistochemical מאשרת את נוכחותו של תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, כלי הדם וכלי הלימפה. בddition, תיוג רקמות עם BSI-לקטינים מאפשר השוואת הזמן לשגות של אזורי רשת המקומיים לפני ואחרי הגירוי גורם בסרום או צמיחה מאופיינת הנבטה וצפיפות כלי נימים מוגברות. לשם השוואה למודלי תרבית תאים נפוצים, שיטה זו מספקת כלי ללימודי שושלת תא האנדותל וערכת תרופת angiogenic רקמות ספציפית ברשתות כלי דם רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.
Introduction
צמיחת שיפוץ רשת כלי דם הם מכנים משותפים לתפקוד רקמות, ריפוי פצעים, ו פתולוגיות מרובות תהליך מפתח הוא אנגיוגנזה, כהגדרתו הצמיחה של כלי דם חדשים קיימים 1, 2. עבור הנדסת רקמות כלי דם חדש או בעיצוב טיפולים מבוססים angiogenic, הבנת חשיבות הדינמיקה הסלולר המעורבת אנגיוגנזה הוא קריטי. עם זאת, תהליך זה הוא מורכב. זה יכול להשתנות במקומות ספציפיים בתוך רשת כלי דם וכרוך סוגי תאים מרובים (כלומר תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, מקרופאגים, תאי גזע) ומערכות מרובות (רשתות לימפטי רשתות עצביות). למרות מודלים במבחנה תרמו מאוד כדי לבדוק את הקשר בין תאים שונים המעורבים אנגיוגנזה 3, הרלוונטי הפיזיולוגית שלהם יכול להתערער בשל thei r מורכבות מוגבלות ואת העובדה שהם מקרוב אינם משקפים תרחיש vivo. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכות תרבות תלת מימדי 3, לשעבר vivo מודלים רקמות 4, מערכות microfluidic 5, 6, ו מודלים חישוביים 7 פותחו שהונהגה בשנים האחרונות. עם זאת, יש עדיין צורך מודל עם יכולת הזמן לשגות לחקור אנגיוגנזה ברשתות פגעו כלי דם vivo לשעבר. הקמת מודלים חדשים זמן לשגות ללימודי אנגיוגנזה עם כי רמת המורכבות תספק כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים המסדירים אנגיוגנזה לשפר טיפולים.
מודל פוטנציאלי המאפשר חקירת vivo לשעבר של אנגיוגנזה ברחבי רשת כלי דם ללא פגע הוא מודל התרבות לפדר עכברוש> 8. בשנים אחרונה עבודה, אנחנו הוכחנו כי דם ורשתות כלי דם הלימפה להישאר קיימא אחרי התרבות. יתרה מכך, מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא פונקציונליות-אנדותל pericyte, דם וקשרי תא האנדותל הלימפה, הזמן לשגות הדמיה. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול שלנו שיטת הדמיה זמן לשגות. תוצאות הנציג שלנו לתעד את סוגי התאים המרובים שנותרו קיימא לאחר הגירוי של אנגיוגנזה עם סרום ולהציע דוגמאות לשימוש בשיטה זו לכימות תגובות angiogenic רקמות ספציפיות, כמו גם מחקרי מעקב תא האנדותל.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתעד שיטה לשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר ככלי vivo לשעבר הדמיה זמן לשגות של צמיחה רשת כלי הדם. עבודה קודמת שנערכו במעבדה שלנו הקימה את השימוש במודל שלנו עבור 1) אנגיוגנזה 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) אינטראקציות תא pericyte-אנדותל <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
