Summary

<em> Ex Vivo</em> Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей

Published: February 09, 2017
doi:

Summary

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Abstract

Ангиогенез, определяемый как рост новых кровеносных сосудов из уже существующих судов, включает в себя эндотелиальные клетки, перицитов, гладкие мышечные клетки, клетки иммунной системы, а также координацию с лимфатическими сосудами и нервами. Нескольких ячеек, многоступенчатая система взаимодействия требует исследование ангиогенеза в физиологически соответствующей среде. Таким образом, в то время как использование в пробирке моделей клеточных культур обеспечили механистических понимание, общая критика в том , что они не перепросматривать сложности , связанные с сетью микрососудов. Целью данного протокола является демонстрация возможности сделать покадровой сравнения неповрежденных микрососудистых сетей до и после стимуляции ангиогенеза в культуре тканей крыс брыжейки. Культивированный ткани содержат микрососудистых сетей, которые поддерживают их иерархию. Иммуногистохимическое маркировка подтверждает наличие эндотелиальных клеток, клеток гладкой мускулатуры, перицитов, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов. Вddition, мечения тканей с BSI-лектинов позволяет сравнение замедленную регионов локальной сети до и после сыворотки или фактора роста стимуляции характеризуется повышенной капиллярной всходов и плотности сосудов. По сравнению с моделями общих клеточных культур, этот метод обеспечивает инструмент для исследования эндотелиальных клеток линии дифференцировки и ткани специфического ангиогенного оценки лекарственных средств в физиологически соответствующих капиллярных сетей.

Introduction

Рост сети микрососудов и ремоделирования являются общие знаменатели для функции тканей, заживление ран, а также несколько патологий и ключевой процесс ангиогенеза, определяется как рост новых кровеносных сосудов из существующих 1, 2. Для тканевой инженерии новых сосудов или проектирование ангиогенные терапии на основе, понимая важность клеточной динамики, вовлеченных в ангиогенез имеет решающее значение. Тем не менее, этот процесс является сложным. Он может варьироваться в определенных местах в пределах сети микрососудов и включает в себя несколько типов клеток (т.е. эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц, перицитов, макрофаги, стволовые клетки) и несколько систем (лимфатическую сети и нейронных сетей). Хотя модели в пробирке внесли огромный вклад в изучение взаимосвязи между различными клетками , участвующими в ангиогенезе 3, их физиологическое значение может быть подорвана из – за Thei г ограниченную сложность и тот факт , что они не точно отражают сценарий в естественных условиях. Для преодоления этих ограничений, трехмерных систем культивирования 3, исключая виво модели ткани 4, микрофлюидальные системы 5, 6, и вычислительные модели 7 были разработаны и внедрены в последние годы. Тем не менее, все еще существует необходимость в модели с возможностью покадровой для исследования ангиогенеза в неповрежденных микрососудистых сетях бывших естественных условиях. Создание новых моделей покадровой для изучения ангиогенеза с этим уровнем сложности обеспечит бесценным инструментом, чтобы понять основные механизмы, регулирующие ангиогенез и улучшить методы лечения.

Потенциальная модель , которая позволяет ех естественных условиях исследование ангиогенеза через неповрежденной сети микрососудов является брыжейки модель культуры крысы> 8. В недавней работе мы показали, что в крови и лимфатической микрососудистых сети остаются жизнеспособными после культивирования. Что еще более важно, брыжейки модель культуры крысы могут быть использованы для исследования функциональных перицитов-эндотелиальной взаимодействия клеток, крови и лимфатической соединений эндотелиальных клеток и покадровой обработки изображений. Целью данной работы является предоставление нашего протокола для метода формирования изображений в заданный промежуток времени. Наши показательные результаты документирования нескольких типов клеток, которые остаются жизнеспособными после стимуляции ангиогенеза с сывороткой и предлагают примеры использования этого метода для количественной оценки тканей специфические ангиогенные ответов, а также исследования отслеживания клеток эндотелия.

Protocol

Все эксперименты на животных и процедуры были одобрены Institutional Animal Care и использования Комитетом по Tulane университета (IACUC) путем. 1. Хирургическая процедура настройки Автоклавы инструменты, хирургические принадлежности и расходные материалы культуры до операции. Х?…

Representative Results

После 3 -х дней в культуре ткани были помечены живой / мертвой комплекту жизнеспособность / цитотоксичность , чтобы продемонстрировать жизнеспособность микрососудов у крыс брыжейки модели культуры (фиг.2А). Большинство клеток, присутствующих в брыжейки остают…

Discussion

Этот протокол документов метод с использованием модели культуры крысы брыжейки в качестве инструмента для экс естественных условиях покадровой визуализации роста микрососудистой сети. Предыдущая работа в нашей лаборатории установила использование нашей модели 1) ангиогенеза <s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Materials

Drape Cardinal Health 4012 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5ml Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/ml
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).

Play Video

Cite This Article
Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

View Video