ل<em> فيفو السابقين</em> طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة من قبل، ينطوي على الخلايا البطانية، pericytes، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا المناعية، والتنسيق مع الأوعية اللمفاوية والأعصاب. الخلية متعددة، والتفاعلات المتعددة نظام تستلزم التحقيق في الأوعية الدموية في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وهكذا، في حين أن استخدام في المختبر نماذج لزراعة الخلايا قدمت رؤى الآلية، نقد شيوعا هو أنها لا ألخص التعقيدات المرتبطة مع شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات القدرة على إجراء مقارنات الوقت الفاصل بين شبكات الاوعية الدموية الدقيقة على حالها قبل وبعد تحفيز الأوعية الدموية في أنسجة الفئران مساريق مثقف. الأنسجة مثقف تحتوي على شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي تحافظ على التسلسل الهرمي بهم. وضع العلامات المناعى يؤكد وجود خلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العضلية الملساء، pericytes والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية. فيddition، واصفة الأنسجة مع BSI-كتين يمكن مقارنة الوقت الفاصل بين المناطق الشبكة المحلية قبل وبعد التحفيز مصل أو عامل النمو يتسم بزيادة تنتشر الشعرية وكثافة السفينة. في مقارنة لنماذج ثقافة الخلية المشتركة، وهذه الطريقة توفر أداة لدراسات الخلايا البطانية النسب والأنسجة التقييم المحددة المخدرات عائية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Introduction
نمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، وإعادة عرض وقواسم مشتركة من أجل وظيفة الأنسجة، والتئام الجروح، وأمراض متعددة وعملية رئيسية هي الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من القائمة 1 و 2. لهندسة الأنسجة سفن جديدة أو تصميم العلاجات عائية القائمة على فهم أهمية ديناميات الخلوية العاملة في الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك، فإن هذه العملية معقدة. يمكن أن تختلف في مواقع محددة داخل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة ويشمل أنواع خلايا متعددة (أي الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، pericytes، الضامة، والخلايا الجذعية) وأنظمة متعددة (شبكات اللمفاوية والشبكات العصبية). على الرغم من أن في المختبر نماذج ساهمت الى حد كبير في دراسة العلاقة بين الخلايا المختلفة المشاركة في الأوعية الدموية 3، يمكن أن تقوض أهميتها الفسيولوجية بسبب thei ص تعقيد محدود، وحقيقة أنها لا تعكس بشكل وثيق سيناريو في الجسم الحي. للتغلب على هذه القيود، ونظم ثقافة ثلاثية الأبعاد 3، المجراة سابقا نماذج الأنسجة 4، أنظمة الموائع الدقيقة 5 و 6 و 7 النماذج الحسابية تم تطويرها وتقديمها في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة لنموذج مع القدرة على مرور الزمن لتحقيق الأوعية الدموية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة خارج الحي. وإنشاء نماذج الوقت الفاصل جديدة للدراسات الأوعية الدموية مع هذا المستوى من التعقيد توفر أداة لا تقدر بثمن لفهم الآليات الكامنة وراء تنظيم الأوعية الدموية وتحسين العلاجات.
نموذج محتمل تمكن التحقيق المجراة سابقا من الأوعية الدموية عبر شبكة الاوعية الدموية الدقيقة سليمة والفئران نموذج الثقافة مساريق> 8. في الأعمال الأخيرة، لقد أثبتنا أن الدم وشبكات الاوعية الدموية الدقيقة اللمفاوية تبقى قابلة للحياة بعد الثقافة. الأهم من ذلك، نموذج ثقافة مساريق الفئران يمكن استخدامها لتحقيق الوظيفية التفاعلات خلية حوطية البطانية الخلايا والدم وصلات الخلايا البطانية اللمفاوية، والوقت الفاصل بين التصوير. الهدف من هذه الورقة هو تقديم لدينا بروتوكول للأسلوب التصوير في الوقت الفاصل بين. وثيقتنا نتائج ممثل أنواع الخلايا المتعددة التي تبقى قابلة للحياة بعد تحفيز الأوعية الدموية مع الدم وتقديم أمثلة على استخدام هذا الأسلوب لتحديد كمية الأنسجة ردود عائية محددة وكذلك البطانية دراسات تتبع الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يوثق طريقة لاستخدام نموذج الثقافة الفئران مساريق كأداة خارج الجسم الحي للتصوير الوقت الفاصل بين النمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وقد أنشأت الأعمال السابقة في مختبرنا استخدام نموذجنا لل1) الأوعية الدموية 8، 2) lymphangiogenesis <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
