Een<em> Ex Vivo</em> Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten, omvat endotheelcellen, pericyten, gladde spiercellen, immuuncellen en de coördinatie met lymfevaten en zenuwen. De meercellige, multi-gebruikersinvoer noodzakelijk het onderzoek naar angiogenese in een fysiologisch relevante omgeving. Terwijl dus het gebruik van in vitro celcultuur modellen mechanistische inzichten verschaft een gemeenschappelijke kritiek is dat ze niet de complexiteit geassocieerd met microvasculaire netwerk recapituleren. Het doel van dit protocol is de mogelijkheid om time-lapse vergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken voor en na angiogenese stimuleren in gekweekte rat mesenterium weefsels aangetoond. Gekweekte weefsels bevatten microvasculaire netwerken die hun hiërarchie te handhaven. Immunohistochemische labeling bevestigt de aanwezigheid van endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, bloedvaten en lymfevaten. In eenddition, het labelen van weefsels met BSI-lectine maakt time-lapse vergelijking van lokale netwerk regio's voor en na het serum of groeifactor stimulatie gekenmerkt door verhoogde capillaire kiemen en vaatdichtheid. In vergelijking met gewone celcultuur modellen, deze methode biedt een instrument voor endotheelcellen lineage studies en weefsel specifieke angiogene evaluatie drug in fysiologisch relevante microvasculaire netwerken.
Introduction
Microvasculaire netwerk groei en hermodellering gemeenschappelijke kenmerken voor weefselfunctie, wondgenezing en meerdere pathologieën en een sleutelproces is angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit bestaande 1, 2. Voor tissue engineering van nieuwe vaten of ontwerpen angiogene therapieën, het begrijpen van het belang van de cellulaire dynamiek betrokken bij angiogenese cruciaal. Dit proces is complex. Het kan variëren op specifieke locaties binnen een microvasculaire netwerk en omvat meerdere celtypen (bijvoorbeeld endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, macrofagen, stamcellen) en meerdere systemen (lymfatische netwerken en neurale netwerken). Hoewel in vitro modellen enorm hebben bijgedragen aan onderzoek naar het verband tussen de verschillende cellen die betrokken zijn bij angiogenese 3, kunnen hun fysiologische relevantie worden ondermijnd als gevolg van thei r beperkte complexiteit en het feit dat zij niet nauw weerspiegelen een in vivo scenario. Om deze beperkingen driedimensionale kweek te overwinnen 3, ex vivo weefselmodellen 4, microfluïdische systemen 5, 6 en 7 rekenmodellen ontwikkeld en in de afgelopen jaren. Er is echter nog steeds behoefte aan een model met time-lapse vermogen om angiogenese in intacte microvasculaire netwerken ex vivo te onderzoeken. De oprichting van de nieuwe time-lapse modellen voor angiogenese studies met dat niveau van complexiteit zal een waardevol instrument om de onderliggende mechanismen tot regeling van angiogenese te begrijpen en om therapieën te verbeteren.
Een potentiële model dat de ex vivo onderzoek naar angiogenese over een intacte microvasculaire netwerk mogelijk maakt is de rat mesenterium cultuur model> 8. In recent werk, hebben we aangetoond dat bloed en lymfestelsel microvasculaire netwerken levensvatbaar na cultuur blijven. Wat nog belangrijker is, kan de rat mesenterium cultuur model gebruikt worden om functionele pericyte-endotheliale cel interacties, het bloed en lymfatische endotheelcellen verbindingen, en time-lapse imaging onderzoeken. Het doel van dit document is ons protocol voor de time-lapse imaging werkwijze. De representatieve resultaten documenteren de verschillende celtypen die levensvatbaar blijft na stimulatie van angiogenese met serum en bieden voorbeelden van deze methode voor het kwantificeren weefselspecifieke angiogene responsen en endotheelcel tracking studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol documenteert een methode voor het gebruik van de rat mesenterium cultuur model als een ex vivo tool voor time-lapse beeldvorming van de groei microvasculaire netwerk. Contract in ons laboratorium is het gebruik van onze model 1) angiogenese 8, 2) lymfangiogenese 8, 3) pericyte-endotheelcelinteracties 8 en 4) anti-angiogene drug testen 9 ingesteld. De mogelijkheid voor het afbeelden gekweekte rat mesenter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
