Analizando Synaptic Modulación de<em> Drosophila melanogaster</em> Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

La modulación de la función sináptica contribuye a la notable capacidad del sistema nervioso para responder con precisión o adaptarse al cambio de los estímulos ambientales. Ajuste de la probabilidad de liberación de la vesícula presináptica es una forma de controlar la fuerza sináptica ^1. La liberación de vesículas sinápticas se lleva a cabo en la Zona Activa (AZ), una región especializada de la membrana presináptica ^2. El AZ se caracteriza por un casete de proteínas específicas ^{3, 4.} La mayoría de las proteínas que contribuyen a la asamblea AZ están muy conservadas en los nematodos, insectos y mamíferos ^5. Estudios recientes sugieren que el nivel de actividad neuronal regula la composición molecular de la AZ, que a su vez contribuye a la regulación de la salida funcional tanto in vitro como in vivo ^{6, 7,}> 8. Hemos determinado anteriormente que AZS fotorreceptoras se someten a la remodelación molecular en Drosophila después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural de ^9. En esta condición, se observó que el número de Bruchpilot (BRP) -positivo AZS se redujo en el axones fotorreceptoras.

Las proteínas Brp / REPARTO familia / ELKS son bloques de construcción fundamentales de AZS en vertebrados e invertebrados sinapsis ^10. En los mutantes de Drosophila BRP, evocó la liberación de vesículas se suprime ^{11, 12.} Los 17 residuos de aminoácidos C-terminales de Brp son esenciales para la agrupación de vesículas sinápticas en la Drosophila unión neuromuscular (NMJ) ^{13, 14.} Estos estudios demostraron el papel central de esta molécula en la organización y la función AZ. Con una herramienta genética desarrollada recientemente, Synaptic etiquetado con recombinación (estrella), Brppuede observarse in vivo en tipos celulares específicos, en los niveles de expresión endógenos y en una sola resolución sinapsis ^15. Esta herramienta hace que sea factible para evaluar la dinámica endógenos de sinapsis cuantitativamente en el sistema nervioso central complejo.

Se han realizado varios estudios que incluyen cuantificaciones sinápticas en base a los datos obtenidos de la microscopía confocal. alteraciones sinápticas se han evaluado mediante la medición de la longitud, el área, el volumen, la densidad y contando el número en base a aplicaciones de software sofisticados. Por ejemplo, el software gratuito ImageJ proporciona un método de cuantificación para el área sináptica total y medidas de densidad sináptica en la Drosophila NMJ ^16. El número de sitios de colocalización de los marcadores pre y post-sinápticas se han cuantificado usando el plugin "puntos lagrimales Analizador" disponible en la plataforma de software ImageJ ^17. Alternativamente, un multi-parprograma basado adigm entorno de computación numérica, Synapse Detector (SYND), puede rastrear automáticamente dendritas de las neuronas marcadas con un marcador fluorescente, y después cuantifica los niveles de proteína sináptica como una función de la distancia desde el cuerpo celular ^18. El software de análisis de Synaptic puntos lagrimales (SynPAnal), ha sido diseñado para el análisis rápido de imágenes en 2D de las neuronas adquiridas de microscopía confocal o fluorescente. La función principal de este software es la cuantificación automática y rápida de la densidad y la intensidad de puntos lagrimales proteína ^19. Recientemente, un algoritmo de detección automática de sinapsis basado en el aprendizaje ha sido generada para la cuantificación del número de sináptica en 3D ^20, aprovechando el software asistida por visualización 3D Análisis (Vaa3D) ^21.

software de análisis de imagen comercial también son herramientas poderosas para cuantificaciones sinápticas. Por ejemplo, la fluorescenciareceptores de neurotransmisores marcado o un componente AZ presináptica se han cuantificado en tres dimensiones con la resolución de una sola sinapsis en C. elegans ²² o el sistema de Drosophila olfativo ^{23, 24,} lo que permite cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra.

A continuación, presentamos un método por un software de análisis de imagen personalizada de plug-in implementado en un entorno de computación numérica multi-paradigma que permite analizar de forma semiautomática múltiples aspectos de AZS, incluyendo su número, la distribución y el nivel de enriquecimiento de los componentes moleculares de el AZ. Por lo tanto, este análisis complejo nos permitió evaluar la dinámica de los componentes sinápticos en terminales de los axones en diferentes condiciones ambientales. Se investigó el efecto de la exposición a la luz en las sinapsis de salida de los fotorreceptores de moscas adultas. El procedimiento se realiza en tres pasos: 1)preparación para la exposición a la luz, 2) la disección, inmunohistoquímica y microscopía confocal, y 3) el análisis de imágenes.