ניתוח Synaptic אפנון של<em> תסיסנית</em> קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

האפנון של פונקציה סינפטי תורם ליכולת המדהימה של מערכת העצבים להגיב בדיוק או להסתגל לשינוי לגירויים סביבתיים. התאמת הסתברות שחרור שלפוחית presynaptic היא אחת דרכים של שליטת כוח הסינפטי ^1. שחרור שלפוחית סינפטית מתקיים האיזור הפעיל (AZ), אזור מיוחד של הקרום presynaptic ^2. AZ מאופיין קסטה של חלבונים ספציפיים ^{3, 4.} רוב החלבונים תורמים הרכבת AZ הם שמורים ביותר נמטודות, חרקים ויונקים ^5. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי רמת הפעילות העצבית מסדיר את ההרכב המולקולרי של AZ, אשר בתורו תורם הסדרת פלט פונקציונלי הן במבחנה in vivo ^{6, 7,}> 8. מצאנו בעבר כי AZS קולטי האור לעבור שיפוץ מולקולרי תסיסנית לאחר חשיפה ממושכת לאור ⁹ הסביבה טבעית. במצב זה, צפינו שמספר Bruchpilot (BRP) -positive AZS הופחת אקסונים קולטי האור.

החלבונים המשפחה BRP / CAST / Elks הם אבני הבניין הבסיסיות של AZS סינפסות חוליות ונטול עצמות ^10. מוטנטים תסיסנית BRP, עורר שחרור שלפוחית מדוכא ^{11, 12.} 17 שאריות חומצת אמינו C- מסוף של BRP חיוניים אשכולות שלפוחית סינפטית בצומת Neuromuscular תסיסנית (NMJ) ^{13, 14.} מחקרים אלה הוכיחו את תפקידה המרכזי של מולקולה זו בארגון AZ ותפקוד. עם כלי גנטי שפותח לאחרונה, Synaptic תיוג עם רקומבינציה (כוכב), BRPניתן להבחין in vivo ב סוגי תאים מסוימים, ברמות ביטוי אנדוגני ברזולוציה סינפסה אחת ^15. כלי זה עושה את זה אפשרי להעריך את הדינמיקה אנדוגני של סינפסות כמותית במערכת העצבים המרכזית המורכבת.

היו מספר מחקרים כולל quantifications סינפסה על בסיס נתונים המתקבלים מן מיקרוסקופיה confocal. שינויי Synaptic הוערכו על ידי מדידת האורך, באזור, ההיקף, הצפיפות וספירת המספר המבוססים על יישומי תוכנה מתוחכמים. למשל, ImageJ החופשית מספקת שיטת כימות לאזור הסינפטי הכולל ואמצעי צפיפות הסינפטי ב תסיסנית NMJ ^16. מספר האתרים colocalization של סמנים טרום postsynaptic כבר לכמת באמצעות התוסף "Analyzer puncta" זמין על פלטפורמת ImageJ תוכנה ^17. לחלופין, א-נקוב רבתכנית מבוססת סביבת מחשוב המספרית adigm, גלאי סינפסה (synd), יכולה לעקוב אחר דנדריטים של נוירונים שכותרתו אוטומטית עם סמן פלואורסצנטי, ולאחר מכן מכמתת את רמות החלבון הסינפטי כפונקציה של מרחק מגוף התא ^18. תוכנת Synaptic puncta הניתוח (SynPAnal), תוכננה עבור הניתוח המהיר של תמונות 2D של נוירונים רכשו במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. התפקיד העיקרי של תוכנה זו היא כימות אוטומטית ומהירה של צפיפות ועוצמת חלבון puncta ^19. לאחרונה, אלגוריתם זיהוי סינפסה אוטומטית מבוססי למידה נוצר כימות של מספר הסינפטי ב -3 D ^20, ניצול של 3D ויזואליזציה בסיוע ניתוח (Vaa3D) תוכנה ^21.

תוכנת ניתוח תמונה מסחרית הם גם כלים רבים עצמה עבור quantifications הסינפטי. למשל, fluorescentlyקולטני הנוירוטרנסמיטר שכותרתו או רכיב AZ presynaptic כבר לכמת בשלושה ממדים עם ברזולוציה יחיד סינפסה ב C. elegans ²² או מערכת חוש הריח תסיסנית ^{23, 24,} המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות בתוך מדגם יחיד.

כאן, אנו מציגים שיטה ידי תוכנת ניתוח תמונה אישית תוספת מיושמת בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה המאפשרת לנתח חצי אוטומטית מגוון רחב של אספקטי AZS, לרבות מספרם, הפצה ברמת ההעשרה של רכיבים מולקולריים במדריך המפות. לפיכך, ניתוח מורכב זה אפשר לנו להעריך את הדינמיקה של רכיבים סינפטיים במסופי האקסון בתנאים סביבתיים שונים. חקרנו את שפעת חשיפת אור על סינפסות הפלט של קולטני אור זבוב בוגר. ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1)לקראת חשיפה לאור, 2) לנתיחה, אימונוהיסטוכימיה ו הדמיה confocal, ו -3) ניתוח התמונה.