تحليل متشابك التحوير من<em> ذبابة الفاكهة</em> خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة
Summary
نحن هنا تظهر كيفية تحديد عدد والتوزيع المكاني للمناطق نشطة متشابك في المستقبلات الضوئية البطن ذبابة الفاكهة، سلط الضوء مع الواسمات الجزيئية المشفرة وراثيا، وتعديل على بعد التعرض لفترات طويلة للضوء.
Abstract
الجهاز العصبي لديه قدرة ملحوظة على التكيف والاستجابة للمؤثرات المختلفة. ويتحقق هذا التعديل العصبي إلى حد كبير من خلال اللدونة على مستوى متشابك. المنطقة النشطة (أ-ي) هي المنطقة في الغشاء قبل المشبكي التي تتوسط الافراج عن العصبي ويتكون من مجموعة كثيفة من البروتينات سقالة. AZS من ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) المستقبلات الضوئية تخضع لإعادة الجزيئي بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعي. وبالتالي فإن مستوى نشاط الخلايا العصبية يمكن إعادة ترتيب التركيب الجزيئي للمن الالف إلى الياء والمساهمة في تنظيم الانتاج وظيفية.
بدءا من التعرض للضوء إعداد انشاء لالمناعية، تفاصيل هذا البروتوكول كيفية تحديد عدد، والتوزيع المكاني، ومستوى تمركز جزيئات متشابك في AZS في المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة. عن طريق تحليل الصور البرمجtware، تم تحديد مجموعات من المكون AZ-تنصهر GFP Bruchpilot لكل R8 مبصرة (R8) محطة محور عصبي. تم تعيين الكشف عن البقع Bruchpilot تلقائيا إلى محاور R8 الفردية. لحساب توزيع تردد بقعة على طول المحور، نفذنا البرنامج المساعد البرمجيات المخصصة. وقد تم تحديد بداية نقطة لكل محور عصبي ونقطة النهاية يدويا، وكان من المتوقع على الخط الذي يربط بين بداية ونقطة النهاية موقف كل بقعة Bruchpilot. إلى جانب عدد من مجموعات Bruchpilot، ونحن أيضا كميا مستوى تمركز Bruchpilot-GFP ضمن مجموعات. وتعكس هذه القياسات بالتفصيل ديناميات متشابك حل مكانيا في الخلايا العصبية واحدة تحت ظروف بيئية مختلفة للمؤثرات.
Introduction
التشكيل وظيفة متشابك يساهم في قدرة ملحوظة في الجهاز العصبي للرد على وجه التحديد أو التكيف مع تغير المحفزات البيئية. ضبط قبل المشبكي إطلاق سراح الحويصلة احتمال هي طريقة واحدة للسيطرة على قوة متشابك 1. متشابك الافراج عن حويصلة يحدث في المنطقة النشطة (AZ)، وهي منطقة متخصصة للغشاء قبل المشبكي 2. يتميز من الألف إلى الياء من قبل كاسيت بروتينات معينة 3، 4. معظم البروتينات التي تسهم في التجمع من الالف إلى الياء والحفظ جدا في الديدان الخيطية والحشرات والثدييات 5. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن مستوى نشاط الخلايا العصبية وينظم التركيب الجزيئي من الألف إلى الياء، وهذا بدوره يساهم في تنظيم الانتاج وظيفية على حد سواء في المختبر والمجراة 6، 7،> 8. لقد وجدنا سابقا أن AZS مبصرة تخضع إعادة الجزيئي في ذبابة الفاكهة بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعية 9. في هذه الحالة، لاحظنا أن عدد Bruchpilot (بدر) -positive AZS تم تخفيض في المحاور مبصرة.
البروتينات بدر / CAST / عائلة الايائل هي اللبنات الأساسية للAZS في الفقاريات واللافقاريات نقاط الاشتباك العصبي 10. في المسوخ BRP ذبابة الفاكهة، أثار إطلاق سراح الحويصلة يتم منعها 11 و 12. بقايا الأحماض الأمينية C-محطة 17 من بدر ضرورية لتجميع حويصلة متشابك في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) 13، 14. وأظهرت هذه الدراسات على الدور المحوري لهذا الجزيء في المؤسسة من الألف إلى الياء وظيفة. مع أداة الوراثية التي تم تطويرها مؤخرا، متشابك توصيف مع إعادة التركيب (STAR)، بدريمكن ملاحظتها في الجسم الحي في أنواع معينة من الخلايا، في مستويات التعبير الذاتية وعلى قرار المشبك واحد 15. هذه الأداة يجعل من الممكن لتقييم ديناميات الذاتية من نقاط الاشتباك العصبي كميا في الجهاز العصبي المركزي معقدة.
كانت هناك العديد من الدراسات بما في ذلك التحديد الكمي المشبك استنادا إلى بيانات تم الحصول عليها من الفحص المجهري متحد البؤر. تم تقييم التعديلات متشابك من خلال قياس الطول، المنطقة، وحجم، وكثافة وتحصي عدد استنادا إلى تطبيقات البرمجيات المتطورة. على سبيل المثال، يوفر يماغيج مجانية طريقة القياس الكمي لمجموع مساحة متشابك والتدابير كثافة متشابك في ذبابة الفاكهة NMJ 16. وقد تم تقدير عدد المواقع colocalization من علامات قبل وبعد المشبكي باستخدام البرنامج المساعد "نقاط ومحلل" متاح على منصة برنامج ImageJ 17. بدلا من ذلك، متعدد قدم المساواةبرنامج يستند إلى adigm العددية بيئة الحوسبة، المشبك الكاشف (SYND)، ويمكن تتبع تلقائيا التشعبات من الخلايا العصبية المسماة مع علامة فلوري، ثم يقيس مستويات بروتين متشابك بوصفها وظيفة من المسافة من جسم الخلية 18. وقد تم تصميم البرنامج متشابك تحليل نقاط و(SynPAnal)، لتحليل السريع للصور 2D من الخلايا العصبية المكتسبة من متحد البؤر المجهري أو الفلورسنت. وتتمثل المهمة الرئيسية لهذا البرنامج هي الكمي التلقائي والسريع في كثافة وشدة من البروتين نقاط و19. مؤخرا، تم إنشاء القائم على التعلم خوارزمية الكشف المشبك التلقائي لتقدير عدد متشابك في 3D 20، والاستفادة من البرنامج المساعد التصور-3D تحليل (Vaa3D) 21.
صورة التجارية برامج التحليل أيضا أدوات قوية لالتحديد الكمي متشابك. على سبيل المثال، fluorescentlyتم كميا مستقبلات الناقل العصبي المسمى أو مكون من الالف إلى الياء قبل المشبكي في ثلاثة أبعاد مع الدقة المشبك واحد في C. ايليجانس 22 أو نظام ذبابة الفاكهة حاسة الشم 23، 24، مما سمح لمئات من نقاط الاشتباك العصبي إلى أن تتسم بسرعة في عينة واحدة.
هنا، فإننا نقدم وسيلة من برنامج تحليل صورة مخصصة المكونات في تنفيذها في عدة نموذج بيئة الحوسبة العددية التي تسمح لتحليل جوانب شبه تلقائيا متعددة من AZS، بما في ذلك عددهم والتوزيع ومستوى التخصيب من المكونات الجزيئية لل الألف إلى الياء. وهكذا، هذا التحليل المعقد سمح لنا لتقييم ديناميات مكونات متشابك في محطات محوار تحت ظروف بيئية مختلفة. نحن التحقيق في تأثير التعرض للضوء على نقاط الاشتباك العصبي الناتج من خلايا مستقبلة للضوء ذبابة الكبار. يتم تنفيذ الإجراء في ثلاث خطوات: 1)استعدادا لالتعرض للضوء، 2) تشريح، المناعية والتصوير متحد البؤر، و3) تحليل الصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وأظهرت لنا كيفية إعداد ظروف الإضاءة لفضح الذباب لشدة الضوء متساوية. نحن كميا ليس فقط على عدد من نقاط وعلامة متشابك ولكن يمكن أيضا حل مكانيا كثافة نقاط الاشتباك العصبي على طول المحاور وقياس مستوى تمركز البروتين علامة في المناطق هيولية. هذه التقييمات ث?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لT. Stürner للتصحيحات مفيدة، المناقشات والتعليقات على المخطوطة. SL Zipursky لتوفير مخزون ذبابة. M Schölling لأداء معالجة الصور. تم تنفيذ جزء من تحليل الصور في مختبر A. Kakita ل. وأيد هذا العمل من قبل الكسندر فون همبولت مؤسسة وJSPS المنح الدراسية للبحوث في الخارج (AS)، JSPS الزملاء (SH-S)، المنح التحتية المعونة من أجل البدء (24800024)، على مناطق المبتكرة (25110713)، موتشيدا، تاكيدا، اينامورى، دايتشي سانكيو-، أسس توراي (TS)، DZNE التمويل الأساسي (GT) ومرفق DZNE ضوء المجهر (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
