Analizzando Synaptic Modulazione di<em> Drosophila melanogaster</em> Fotorecettori dopo l'esposizione alla luce prolungata

La modulazione della funzione sinaptica contribuisce alla notevole capacità del sistema nervoso di rispondere o adattarsi alle mutevoli stimoli ambientali precisione. Regolazione della probabilità di rilascio delle vescicole presinaptico è un modo per controllare la forza sinaptica ^1. Rilascio delle vescicole sinaptiche hanno luogo presso la zona attiva (AZ), una regione specializzata della membrana presinaptica ^2. L'AZ è caratterizzato da una cassetta di proteine specifiche ^{3, 4.} La maggior parte delle proteine che contribuiscono alla AZ di montaggio sono altamente conservati nei nematodi, insetti e mammiferi ^5. Studi recenti suggeriscono che il livello di attività neuronale regola la composizione molecolare del AZ, che a sua volta contribuisce alla regolazione della potenza funzionale sia in vitro che in vivo ^{6, 7,}> 8. Abbiamo già scoperto che AZS fotorecettori subiscono rimodellamento molecolare in Drosophila dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale, ^9. In questa condizione, abbiamo osservato che il numero di Bruchpilot (BPA) -positivo AZS è stata ridotta negli assoni dei fotorecettori.

Le proteine Brp / CAST / famiglia ELKS sono mattoni fondamentali di AZS in vertebrati e invertebrati sinapsi ^10. In Drosophila mutanti BRP, evocato rilascio delle vescicole è soppressa ^{11, 12.} Le 17 residui di aminoacidi C-terminale della Brp sono essenziali per il clustering sinaptica vescicole al Drosophila Giunzione neuromuscolare (NMJ) ^{13, 14.} Questi studi hanno dimostrato il ruolo centrale di questa molecola in organizzazione e funzione AZ. Con uno strumento genetico sviluppato di recente, Synaptic Tagging con ricombinazione (STAR), Brppuò essere osservato in vivo in specifici tipi cellulari, a livelli di espressione endogeni e ad una sola risoluzione sinapsi ^15. Questo strumento rende possibile valutare le dinamiche endogene di sinapsi quantitativamente nel complesso sistema nervoso centrale.

Ci sono stati diversi studi tra cui quantificazioni sinapsi in base ai dati ottenuti da microscopia confocale. alterazioni sinaptiche sono state valutate misurando la lunghezza, la zona, il volume, la densità e contando il numero basato su applicazioni software sofisticate. Per esempio, il freeware ImageJ fornisce un metodo di quantificazione per l'area sinaptica totale e le misure di densità sinaptica alla Drosophila NMJ ^16. Il numero di siti colocalizzazione di marcatori pre e post-sinaptici sono stati quantificati utilizzando il plug-in "Puncta Analyzer" disponibili sulla piattaforma software ImageJ ^17. In alternativa, un multi-parprogramma basato adigm ambiente di calcolo numerico, Synapse Detector (Synd), può tracciare automaticamente dendriti dei neuroni marcati con un marcatore fluorescente, e quindi quantifica i livelli di proteine sinaptiche in funzione della distanza dal corpo cellulare ^18. Il software Synaptic Puncta Analysis (SynPAnal), è stato progettato per l'analisi rapida di immagini 2D di neuroni acquisiti da microscopia confocale o fluorescenti. La funzione principale di questo software è la quantificazione automatica e rapida della densità e l'intensità di proteine puncta ^19. Recentemente, un algoritmo automatico apprendimento basato rilevamento sinapsi è stato generato per la quantificazione del numero sinaptica in 3D ^20, approfittando del software ²¹ Visualizzazione 3D-Assisted Analysis (Vaa3D).

immagine commerciale software di analisi sono anche potenti strumenti per la quantificazioni sinaptiche. Per esempio, la fluorescenzarecettori dei neurotrasmettitori etichettati o un componente presinaptica AZ sono stati quantificati in tre dimensioni con risoluzione di una singola sinapsi in C. elegans ²² o il sistema Drosophila olfattivo ^{23, 24,} permettendo centinaia di sinapsi per essere rapidamente caratterizzato all'interno di un singolo campione.

Qui, presentiamo un metodo con un software di analisi di immagine personalizzata plug-in implementato in un ambiente di calcolo numerico multi-paradigma che permette di analizzare semi-automaticamente molteplici aspetti AZS, tra loro numero, la distribuzione e il livello di arricchimento di componenti molecolari l'AZ. Così, questo complesso di analisi ci ha permesso di valutare la dinamica dei componenti sinaptiche in terminali degli assoni in diverse condizioni ambientali. Abbiamo studiato l'effetto dell'esposizione luce sulle sinapsi di uscita dei fotorecettori mosca adulta. La procedura viene eseguita in tre fasi: 1)preparazione per esposizione alla luce, 2) dissezione, immunoistochimica e confocale, e 3) analisi delle immagini.