Synaptic Modülasyon Analizi<em> Drosophila melanogaster</em> Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler
Summary
Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.
Abstract
sinir sistemi adapte ve çeşitli uyaranlara yanıt olağanüstü bir yeteneği vardır. Bu sinir ayar ölçüde sinaptik düzeyde plastisite ile elde edilir. Aktif bölge (AZ) nörotransmitter salımını aracılık ve iskele proteinlerinin yoğun bir toplama oluşan presinaptik membran bölgedir. Drosophila melanogaster AZS (Drosophila) fotoreseptör doğal ortam ışığına uzun süreli maruz kalma sonrasında moleküler biçimlenme geçmesi. Böylece nöronal aktivitenin düzeyi AZ moleküler kompozisyonu yeniden ve işlevsel çıktı düzenlenmesine katkıda bulunabilir.
Immünohistokimyaya ışığa maruz kalma set-up hazırlanmasından başlayarak, bu protokol numarası, mekansal dağılımı ve Drosophila fotoreseptörlerde AZS sinaptik moleküllerin delokalizasyon seviyesini ölçmek için nasıl ayrıntıları. görüntü analizi sof kullanmayazılımlarını, GFP-kaynaşık AZ bileşeni Bruchpilot kümeleri her R8 fotoreseptör (R8) akson terminal belirlenmiştir. Algılandı Bruchpilot noktalar otomatik olarak bireysel R8 akson ayrıldı. akson boyunca nokta frekans dağılımını hesaplamak için, biz bir özel yazılım eklentisi uyguladı. Her aksonun başlangıç noktası ve bitiş noktası elle tanımlanmış ve her Bruchpilot nokta pozisyonu başlangıç ve bitiş noktası arasındaki bağlantı hattı yansıtılıyor edildi. Bruchpilot küme sayısına yanı sıra, kümeler içinde Bruchpilot-GFP delokalizasyon düzeyini sayılabilir. Bu ölçümler farklı çevresel koşullar altında tek bir nöron mekansal çözüme sinaptik dinamikleri uyaranlara ayrıntılı olarak yansıtmaktadır.
Introduction
sinaptik fonksiyon modülasyonu tam yanıt ya da çevresel uyaranlara değişen uyum sinir sisteminin olağanüstü yeteneği katkıda bulunur. Presinaptik vezikül bırakma olasılığını ayarlanması sinaptik gücü 1 kontrol etmenin bir yoludur. Sinaptik vezikül salım aktif bölge (AZ), presinaptik zar 2'nin özel bir bölgede yer alır. AZ spesifik proteinlerin 3'ün bir kaset, 4 ile karakterize edilir. AZ montaj katkıda Çoğu protein son derece nematod, böcek ve memelilerde 5 korunmuştur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal aktivite düzeyi da hem in vitro ve in vivo 6, 7 fonksiyonel çıkışının düzenlenmesine katkıda AZ, moleküler yapısı düzenleyen düşündürmektedir> 8. Biz daha önce fotoreseptör AZS doğal ortam ışığı 9 uzun süre maruz kaldıktan sonra Drosophila moleküler biçimlenme geçmesi bulundu. Bu durumda biz Bruchpilot (BRP) -pozitif AZS sayısı fotoreseptör aksonlar indirgendi görülmektedir.
BRP / CAST / ELKS ailesi proteinleri omurgalı ve omurgasız sinapsların 10 AZS temel yapı taşlarıdır. Drosophila BRP mutantlar, vezikül açıklaması, 12 11 bastırılır uyarılmış. BRP 17 C-terminali amino asit kalıntıları Drosophila nöromüsküler bileşke (NMJ) 13, 14 sinaptik vezikül Kümelenme için gereklidir. Bu çalışmalar AZ organizasyon ve fonksiyonunda bu molekülün merkezi rolünü göstermiştir. Rekombinasyon (Star), BRP ile son zamanlarda geliştirilen genetik aracı Synaptic Etiketleme ileendojen ekspresyon düzeyleri ve tek bir sinaps çözünürlüğü 15 de, belirli bir hücre tiplerinde in vivo gözlenebilir. Bu araç, bu mümkün nicel olarak karmaşık, merkezi sinir sisteminde sinaps endojen dinamiklerini analiz kolaylaştırır.
konfokal mikroskopi elde edilen verilere dayalı sinaps sayımsal dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Sinaptik değişiklikler uzunluk, alan, hacim, yoğunluk ölçümü ve gelişmiş yazılım uygulamalarına dayalı sayısını sayarak değerlendirilmiştir. Örneğin, ücretsiz ImageJ toplam sinaptik alan ve Drosophila NMJ 16 sinaptik yoğunluk ölçümleri için bir miktar yöntemi sağlar. Önceden ve postsinaptik belirteçlerinin ko sitelerin sayısı ImageJ yazılım platformu 17 mevcut eklenti "puncta Analyzer" kullanılarak sayısal edilmiştir. Seçenek olarak ise, bir multi-paradigm sayısal işlem ortamı tabanlı program, Synapse Dedektörü (SYND), otomatik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketli nöronların dendritler iz ve ardından hücre gövdesine 18 mesafenin bir fonksiyonu olarak sinaptik protein düzeyleri rakamlarla olabilir. Yazılım Sinaptik puncta Analizi (SynPAnal) konfokal veya floresan mikroskobu elde nöronların 2D görüntüler hızlı analizi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu yazılımın ana işlevi protein puncta 19 yoğunluğu ve şiddeti otomatik ve hızlı miktar olduğunu. Son zamanlarda, otomatik öğrenme bazlı sinaps algılama algoritması 3D Görselleştirme Destekli Analizi (Vaa3D) Yazılımın 21 yararlanarak, 3D 20 sinaptik sayısının ölçümü için oluşturuldu.
Ticari görüntü analiz yazılımı da sinaptik sayımsal için güçlü araçlardır. Örneğin, flüoresanetiketli nörotransmiter reseptörleri veya presinaptik AZ bileşeni C. tek sinaps çözünürlüğü 22 elegans veya sinapsların yüzlerce izin Drosophila koku sistemi 23, 24, hızla tek bir numune içinde karakterize edilmesi ile üç boyutlu olarak sayısal edilmiştir.
Burada, özel bir görüntü analiz yazılımı tarafından bir yöntem mevcut plug-in sayıları, dağıtım ve moleküler bileşenleri zenginleştirme düzeyine dahil AZS yarı otomatik olarak birden fazla yönlerini analiz sağlayan bir çoklu-paradigma sayısal bilgi işlem ortamında uygulanan AZ. Bu nedenle, bu karmaşık analiz, farklı çevresel koşullar altında akson terminallerinde bileşenlerin dinamiklerini değerlendirmek için bize izin verdi. Biz yetişkin sinek Fotoreseptörlerin çıkış sinaps üzerinde ışığa maruz kalma etkisi araştırıldı. Prosedür üç adımda gerçekleştirilir: 1)ışığa maruz kalma, 2) diseksiyon, immünhistokimya ve konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi için hazırlık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, biz eşit bir ışık yoğunluğu sinekler ortaya çıkarmak için ışık koşulları nasıl hazırlanacağını gösterdi. Sizlere sadece bir sinaptik işaretleyici puncta sayısını sayısal hem de mekansal akson boyunca sinaps yoğunluğu gidermek ve sitoplazmik alanlarda işaretleyici protein delokalizasyon düzeyini ölçmek olabilir. Bu üç değerlendirmeler bizi farklı çevre koşullarında tek nöron düzeyinde sinaptik dinamikleri ayrıntılarını değerlendirmek için izin verir. Bizim pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının yararlı düzeltmeler, tartışmalar ve yorumlar için T. Stürner minnettarız; sinek stokları sağlamak için SL Zipursky; görüntü işleme gerçekleştirmek için M Schölling. Görüntü analizi Bölüm A. Kakita laboratuarda gerçekleştirilmiştir. Bu eser, Yenilikçi Alanları Başlat-up için Alexander von Humboldt Vakfı ve JSPS Bursu Yurtdışı Araştırma (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-İçi Aid (24800024), (25110713), Mochida tarafından desteklenmiştir Takeda, Inamori Daiichi-Sankyo, Toray Temelleri (TS), DZNE çekirdek finansman (GT) ve DZNE Işık Mikroskopi Tesisi (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
