Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Controle de translação está a emergir como um passo igualmente importante para a regulação da transcrição na expressão do gene, especialmente durante períodos de estresse celular ^1. Um ponto focal de controlo de tradução é para o passo limitante da velocidade de início em que os primeiros passos da síntese de proteínas envolve a ligação do factor eucariótico de iniciação 4E (eIF4E) para o 7-metilguanosina (m ⁷ GTP) 5 'tampão de mRNAs ² . eIF4E é parte de um complexo trimérico chamado eIF4F que inclui elF4A, uma helicase de ARN, e eIF4G, uma proteína andaime necessário para o recrutamento de outros factores de tradução e os ribossomas 40S ^3. Sob condições fisiológicas normais, a grande maioria dos mRNAs são traduzidas por um mecanismo dependente da tampa, mas sob períodos de stress celular, aproximadamente 10% de mRNAs humanos contêm 5 'UTRs que podem permitir a tradução independente de cap iniciação ^1,4. tradução dependente de Cap tem sido historicamente sinônimoous com eIF4F, no entanto, variações específicas de estresse dos eIF4F tornaram-se um trending topic ^5-8.

Várias tensões celulares causar actividade eIF4E a ser reprimido através do alvo de mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1). Esta quinase torna-se prejudicada sob estresse, o que resulta no aumento da atividade de um dos seus alvos, proteína do 4E de ligação (4E-BP). Não fosforilada 4E-BP liga-se a eIF4E e bloqueia a sua capacidade de interagir com eIF4G fazendo com que a repressão da tradução dependente de tampão ^9,10. Curiosamente, um homólogo de eIF4E chamado eIF4E2 (ou 4EHP) tem uma afinidade muito menor para 4E-BP ^11, permitindo que ele talvez para evadir a repressão mediada por stress. Com efeito, caracterizada inicialmente como um repressor da tradução devido à sua falta de interacção com eIF4G ^12, eIF4E2 inicia a tradução de centenas de ARNm que contêm elementos de resposta a hipoxia de ARN na sua UTR 3 'durante o stress hipóxico ^6,13. Este i activaçãos alcançado através de interações com ligação eIF4G3, RNA motivo de proteína 4 e 2α o fator inducible hipoxia (HIF) para constituir um complexo eIF4F hipóxica ou eIF4F ^{H 6,13.} Como um repressor em condições normais, se liga com eIF4E2 GIGYF2 e ZNF598 ^14. Estes complexos foram, em parte, identificados através de m ⁷ resinas GTP de afinidade de agarose ligadas. Este método clássico ¹⁵ é padrão na área de tradução e é os ensaios de melhor e mais comumente utilizado técnica para isolar complexos de ligação de PAC em puxar para baixo e in vitro de ligação ^16-19. À medida que a maquinaria de tradução dependente de tampão está a emergir como flexível e adaptável com partes inter- mudando ^6-8,13, este método é uma ferramenta poderosa para identificar rapidamente novas proteínas de ligação ao tampão envolvidas na resposta ao stress. Além disso, as variações na eIF4F poderia ter implicações amplas como vários sistemas modelo eucarióticos parecem usar um homólogo eIF4E2 para as respostas ao estresse taiscomo A. thaliana ^20, S. Pombe ^{21, 22 de} D. melanogaster e C. elegans ^23.

As evidências sugerem que variações no eIF4F pode não ser estritamente limitado a condições de estresse, mas estar envolvidos na fisiologia normal ^24. O fornecimento de oxigénio para os tecidos (em extremidades capilares) ou dentro dos tecidos (medida através de microeléctrodos) varia de 2-6% no cérebro ^25, 3-12% nos pulmões ^26, 3,5-6% no intestino ^27, 4% em o fígado ^28, 7-12% no rim ^29, 4% no músculo ^30, e 6-7% na medula óssea ^31. Células e mitocôndrias contêm menos de 1,3% de oxigênio ^32. Estes valores são muito mais próximos à hipoxia do que a do ar ambiente, quando as células são cultivadas por rotina. Isto sugere que o que foram previamente pensado como processos celulares específicas de hipóxia pode ser relevante em um ambiente fisiológico. Curiosamente, eIF4F e ^H eIF4F </sup> participar activamente na iniciação da tradução de piscinas distintas ou classes de mRNAs em várias linhas de células humanas diferentes expostas ao oxigénio fisiológica ou "physioxia" ^24. Baixo oxigênio também impulsiona o desenvolvimento fetal adequado ³³ e células geralmente têm taxas mais elevadas de proliferação, a expectativa de vida mais longos, menos danos ao DNA e menos respostas de estresse geral em physioxia ^34. Portanto, é provável ^H eIF4F um factor-chave na expressão de genes selecionados em condições fisiológicas.

Aqui, nós fornecemos um protocolo para células de cultura em condições de oxigénio fisiológicas fixos ou em um intervalo de flutuação dinâmica que é provável mais representativo do microambiente do tecido. Uma vantagem deste método é que as células são lisadas dentro da estação de trabalho hipóxia. Não é claro como muitas vezes a transição a partir da cultura de células hipóxicas à lise das células é realizada em outros protocolos. As células são muitas vezes removidos em primeiro lugar a partir de uma pequena incubadora ser hipoxiatona lise, mas esta exposição ao oxigénio poderia afectar vias bioquímicas como a resposta celular ao oxigénio é rápido (uma ou duas min) ^35. Certas proteínas de ligação PAC necessitem de interações com uma segunda base ou pode hidrolisar o GTP m ^7, portanto, alguns interagentes cap podem ser desperdiçada no processo de purificação. Agarose ligada aos análogos cap resistentes enzimaticamente pode ser substituído neste protocolo. Explorando a atividade e composição do eIF4F ^H e outras variações de eIF4F através do método descrito aqui vai lançar luz sobre os mecanismos de expressão genética intrincados que as células utilizam durante as condições fisiológicas ou respostas ao estresse.