Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l'oxygène

Contrôle translationnelle émerge comme une étape tout aussi important de la régulation transcriptionnelle de l'expression génique, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire ^1. Un point central de contrôle de la traduction est à l'étape de limitation de vitesse d'initiation où les premières étapes de la synthèse des protéines impliquent la liaison de la facteur d'initiation eucaryote 4E (eIF4E) à la 7-méthylguanosine (m ⁷ GTP) coiffe 5 'des ARNm ² . eIF4E fait partie d'un complexe trimère nommé eIF4F qui comprend eIF4A, un ARN hélicase et eIF4G, une protéine d'échafaudage nécessaire pour le recrutement d'autres facteurs de traduction et les 40S ribosome ^3. Dans des conditions physiologiques normales, la grande majorité des ARNm sont traduits par un mécanisme de cap-dépendante, mais sous des périodes de stress cellulaire environ 10% des ARNm humains contiennent 5 'UTR qui pourraient permettre la traduction cap-indépendante intiation ^1,4. Traduction de Cap-dépendante a été synonyme historiquementous avec eIF4F, cependant, des variations spécifiques au stress de eIF4F sont devenus un sujet tendance ^5-8.

Diverses contraintes cellulaires provoquent l'activité eIF4E à être réprimée par la cible mammalienne de la rapamycine complexe 1 (mTORC1). Cette kinase devient douteux sous contrainte, ce qui se traduit par l'augmentation de l'activité de l'un de ses objectifs, la protéine 4E-liaison (4E-BP). Non-phosphorylée 4E-BP se lie à eIF4E et bloque sa capacité à interagir avec eIF4G provoquant la répression de la traduction cap-dépendante ^9,10. Fait intéressant, un homologue de eIF4E nommé eIF4E2 (ou 4EHP) a une affinité beaucoup plus faible pour les 4E-BP ^11, peut – être ce qui lui permet d'échapper au stress médiée par la répression. En effet, tout d' abord caractérisé comme répresseur de la traduction en raison de son manque d'interaction avec eIF4G ^12, eIF4E2 initie la traduction de centaines d'ARNm qui contiennent des éléments de réponse à l'hypoxie d'ARN dans les 3 'UTR lors d'un stress hypoxique ^6,13. Cette i d'activations obtenus par des interactions avec eIF4G3, l' ARN de liaison aux protéines motif 4 et le facteur inductible par l'hypoxie (HIF) , 2α pour constituer un complexe eIF4F hypoxique ou eIF4F ^{H 6,13.} En tant que répresseur dans des conditions normales, eIF4E2 se lie avec GIGYF2 et ¹⁴ ZNF598. Ces complexes ont été, en partie, identifiés par m ⁷ résines GTP d'affinité Agarose liés. Cette méthode classique ¹⁵ est standard dans le domaine de la traduction et les dosages meilleur et le plus couramment utilisé la technique pour isoler les complexes de plafonnement contraignant pull down et in vitro de liaison ^16-19. Comme le mécanisme de traduction cap-dépendante est en train de devenir flexible et adaptable avec des parties inter-changer ^6-8,13, cette méthode est un outil puissant pour identifier rapidement de nouvelles protéines cap de liaison impliqués dans la réponse au stress. Par ailleurs, les variations de eIF4F pourraient avoir de vastes répercussions que plusieurs systèmes modèles eucaryotes semblent utiliser un homologue eIF4E2 pour les réponses de stress tellescomme A. thaliana ^20, S. pombe ^21, D. melanogaster ^22, et C. elegans ^23.

Les preuves suggèrent que les variations de eIF4F peuvent ne pas être strictement limitées aux conditions de stress, mais être impliqués dans la physiologie normale ^24. L'apport d'oxygène aux tissus (au niveau des extrémités des capillaires) ou dans les tissus (mesurée par microélectrodes) varie de 2 à 6% dans le cerveau ^25, 3-12% dans les poumons ^26, 3,5-6% dans l'intestin ^27, 4% le foie ^28, 7-12% dans le rein ^29, 4% dans le muscle ^30, et 6-7% dans la moelle osseuse ^31. Les cellules et les mitochondries contiennent moins de 1,3% d' oxygène ^32. Ces valeurs sont beaucoup plus proches de l'hypoxie que l'air ambiant où les cellules sont cultivées en routine. Cela donne à penser que ce qui était auparavant considéré comme des processus cellulaires spécifiques à l'hypoxie peuvent être pertinents dans un contexte physiologique. Il est intéressant de eIF4F et eIF4F ^H </sup> participer activement à l'initiation de la traduction des piscines ou des classes d'ARNm distincts dans plusieurs lignées cellulaires humaines différentes exposées à l' oxygène physiologique ou "physioxia" ^24. Le manque d' oxygène entraîne également le développement du fœtus ³³ et les cellules ont généralement des taux plus élevés de prolifération, plus la durée de vie, moins de dommages de l' ADN et moins les réactions de stress général dans physioxia ^34. Par conséquent, eIF4F ^H est probablement un facteur clé dans l'expression de certains gènes dans des conditions physiologiques.

Ici, nous fournissons un protocole aux cellules de culture dans des conditions d'oxygène physiologiques fixes ou dans une gamme fluctuant dynamique qui est probablement plus représentatif de microenvironnements tissulaires. Un avantage de cette méthode est que les cellules sont lysées à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie. Il est pas souvent clairement comment la transition de la culture de cellules hypoxiques à la lyse cellulaire est effectuée dans d'autres protocoles. Les cellules sont souvent d'abord retirés d'un petit incubateur d'hypoxie êtreavant la lyse, mais cette exposition à l' oxygène pourrait affecter les voies biochimiques comme la réponse cellulaire à l' oxygène est rapide (une ou deux minutes) ^35. Certaines protéines cap de liaison exigent des interactions avec une seconde base ou peuvent hydrolyser le m ⁷ GTP, donc certains interacteurs cap peuvent manquer dans le processus de purification. Agarose liée aux analogues de cap enzymatiquement résistant peut être substitué dans ce protocole. Exploration de l'activité et la composition des eIF4F ^H et d' autres variations de eIF4F par la méthode décrite ici va faire la lumière sur les gènes machineries d'expression complexes que les cellules utilisent dans des conditions physiologiques ou des réactions de stress.