ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

שליטה Translational מתגלה צעד חשוב לא פחות לרגולציה תעתיק בביטוי הגנים, במיוחד בתקופות של מתח הסלולר ^1. מוקד שליטת תרגום הוא צעד שער הגבלת חניכה שבו הצעדים הראשונים של סינתזת חלבון לערב הכריכה של 4E גורם ייזום איקריוטיים (eIF4E) אל 7-methylguanosine (מ ⁷ GTP) 5 'כובע של mRNAs ² . eIF4E הוא חלק ממכלול trimeric בשם eIF4F הכולל eIF4A, גידול helicase RNA, eIF4G, חלבון פיגומים הנדרש לגיוס של גורמי תרגום אחרים ואת 40S הריבוזום ^3. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, רוב mRNAs המכריע מתורגם באמצעות מנגנון כובע תלוי, אבל תחת תקופות של מתח הסלולר כ 10% של mRNAs האנושי מכילים 5 'UTRs עלולה לאפשר תרגום עצמאי-כובע טכס חניכת ^1,4. תרגום שווה תלויה כבר היסטורי נרדףמפוקפק עם eIF4F, לעומת זאת, וריאציות ספציפי לחץ של eIF4F הפכו נושאי טרנדים ^5-8.

מדגיש תאיים שונה לגרום לפעילות eIF4E צורך להדחיק באמצעות היעד היונק של rapamycin מורכבי 1 (mTORC1). קינאז זה הופך לקוי תחת לחץ, וכתוצאה מכך את הפעילות המוגברת של אחד היעדים שלה, 4E-חלבון מחייב (4E-BP). ללא פוספורילציה 4E-BP נקשר eIF4E וחוסם את יכולתה לקיים אינטראקציה עם eIF4G גורם לדיכוי של תרגום תלוי כובע ^9,10. נקודה מעניינת היא homolog של eIF4E בשם eIF4E2 (או 4EHP) יש זיקה הרבה יותר נמוך עבור 4E-BP ^11, אולי שמאפשר לו לחמוק הדחקה בתיווך מתח. ואכן, בתחילה לאפיין מדכא של התרגום בשל היעדר האינטראקציה עם eIF4G ^12, eIF4E2 יוזם את התרגום של מאות mRNAs המכילים אלמנטים בתגובה היפוקסיה רנ"א 3 שלהם 'UTR במהלך מתח היפוקסי ^6,13. אני הפעלה זושעות מושגת באמצעות אינטראקציות עם eIF4G3, RNA חלבון מחייב מוטיב 4, והגורם היפוקסיה מושרה (HIF) 2α להוות מורכבים eIF4F חוסר חמצן, או eIF4F ^{H 6,13.} כתוצאה מדכאת בתנאים רגילים, eIF4E2 נקשר עם GIGYF2 ו ZNF598 ^14. מתחמים אלה היו, בין שאר, שזוהו באמצעות שרפי זיקת GTP מ ⁷ Agarose צמודים. השיטה הקלאסית זה ¹⁵ הוא תקן בתחום התרגום והוא הטוב ביותר הנפוץ טכניקה לבודד מתחמי מחייב כובע לנתץ ו במבחנה מחייב מבחני ^16-19. כמו מכונות תרגום תלוי כובע מתגלה גמישות להתאמה עם חלקים בין-שינוי ^6-8,13, שיטה זו היא כלי רב עצמה כדי לזהות חלבוני כובע מחייב רומן במהירות מעורב תגובת הלחץ. יתר על כן, וריאציות eIF4F עשויות להיות השלכות רחבות כמערכות מודל מספר איקריוטיים להופיע להשתמש homolog eIF4E2 לתגובות מתח כזהכמו א thaliana ^20, ס Pombe ^21, ד melanogaster ^22, ו- C. elegans ^23.

הראיות עולה כי שינויים eIF4F לא יכול להיות מוגבל למצבי לחץ, אבל להיות מעורבים בפיזיולוגיה נורמלי ^24. אספקת חמצן לרקמות (בקצוות נימי) או בתוך רקמות (נמדד באמצעות microelectrodes) נע בין 2-6% במוח ^25, 3-12% בתוך הריאות ^26, 3.5-6% במעי ^27, 4% ב הכבד ^28, 7-12% בכליה ^29, 4% בשריר ^30, ו 6-7% ב מח עצם ^31. תאי המיטוכונדריה מכילים פחות מ -1.3% חמצן ^32. ערכים אלה הם הרבה יותר קרובים היפוקסיה מאשר באוויר הסביבה שבה תאים בתרבית באופן שגרתי. הדבר מצביע על כך מה בעבר נחשבו כמו תהליכים תאיים ספציפי היפוקסיה עשויים להיות רלוונטיים בסביבה פיזיולוגית. מעניין, eIF4F ו eIF4F ^H </sup> להשתתף באופן פעיל בייזום התרגום של ברכות או כיתות נפרדות של mRNAs בכמה שורות תאים אנושיות שונות נחשפות לחמצן פיסיולוגי או "physioxia" ^24. חמצן נמוך גם דוחפת להתפתחות תקינה של העובר ³³ ותאי בדרך כלל יש שיעורי התפשטות גבוה, תוחלת החיים ארוכה יותר, פחות נזק בדנ"א ותגובות הלחץ הכללי פחות physioxia ^34. לכן, eIF4F ^H עשויה גורם מפתח בביטוי של גנים בוחרים בתנאים פיסיולוגיים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לתאי תרבות בתנאי חמצן פיסיולוגיים קבועים או במגוון משתנה דינמי כי סביר יותר נציג microenvironments רקמות. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי התאים lysed בתוך תחנת עבודה היפוקסיה. לא לעתים קרובות ברור כיצד מעבר מתרבות תא היפוקסי תמוגה התא מתבצע פרוטוקולים אחרים. תאים הם לעתים קרובות להסיר תחילה מן חממת היפוקסיה קטנה להיותקדמי תמוגה, אבל לחשיפה זו חמצן יכולה להשפיע הביוכימיים כתגובה הסלולר לחמצן היא מהירה (אחד או שתיים דקות) ^35. חלבוני כובע מחייב מסוימים דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים hydrolyze GTP מ ^7, ולכן חלק interactors הכובע עלול לרדת לטמיון בתהליך הטיהור. Agarose-צמוד אנלוגים כובע עמיד enzymatically ניתן להחליף בפרוטוקול זה. היכרות עם הפעילות ורכב eIF4F ^H וריאציות אחרות של eIF4F באמצעות השיטה המתוארת כאן שתשפוך אור על מנגנוני ביטוי הגנים המורכבים שתאיים לנצל במהלך מצבים פיסיולוגיים או תגובות דחק.