Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Çeviri kontrol özellikle hücresel stres ¹ dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m ⁷ GTP) mRNA ² 5 'kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S ³ ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 ^1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 'UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu ^5-8 haline gelmiştir.

Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri ^9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP ¹¹ için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G ¹² ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese ^6,13 sırasında 3 'UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F ^{H 6,13} teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 ¹⁴ ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m ⁷ GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem ¹⁵ çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri ^16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar ^6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana ²⁰ gibi, S. Pombe ^21, D ²² melanogaster ve C ²³ elegans.

Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi ²⁴ dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki ^25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde ^26% 3-12, bağırsak ^27,% 4 in 3,5-6% karaciğer ^28, böbrek ^29% 7-12, kas ³⁰ içinde% 4 ve kemik iliği ^31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen ³² daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F ^H </sup> aktif fizyolojik oksijen ya da "physioxia" ²⁴ maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim ³³ sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia ³⁴ daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F ^lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür.

Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) ³⁵ hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m ⁷ GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F ^H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.