Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translationele controle is in opkomst als een even belangrijke stap om gentranscriptieregulatie in genexpressie, vooral in perioden van cellulaire stress ^1. Een brandpunt van de vertaling controle is op de snelheidsbeperkende stap van initiatie, waar de eerste stappen van de eiwitsynthese betrekking hebben op de binding van de eukaryote initiatie factor 4E (eIF4E) naar de 7-methylguanosine (m ⁷ GTP) 5 'cap van mRNA ² . eIF4E maakt deel uit van een trimere complex genaamd eIF4F dat eIF4A, een RNA-helicase en eIF4G, een steiger eiwit nodig is voor de indienstneming van andere vertaling factoren en de 40S ribosoom ³ bevat. Onder normale fysiologische omstandigheden, de meeste mRNA vertaald door een cap-afhankelijk mechanisme, maar onder perioden van cellulaire stress ongeveer 10% van humane mRNAs bevatten 5 'UTR die cap-onafhankelijke translatie waardoor inwijding ^1,4. Cap-afhankelijke vertaling is van oudsher synoniemlende met eIF4F echter, stress-specifieke variaties van eIF4F hebben een trending topic ^5-8 geworden.

Verschillende cellulaire stress veroorzaken eIF4E activiteit die moet worden onderdrukt via de zoogdieren doelwit van rapamycine complex 1 (mTORC1). Dit kinase minder wordt onder stress, wat resulteert in de verhoogde activiteit van een van de doelstellingen, de 4E-bindend eiwit (4E-BP). Niet-gefosforyleerde 4E-BP bindt aan en blokkeert eIF4E zijn vermogen tot interactie met eIF4G waardoor de onderdrukking van cap-afhankelijke translatie ^9,10. Interessant is dat een homoloog van genoemd eIF4E eIF4E2 (of 4EHP) een veel lagere affiniteit voor 4E-BP ^11, waardoor het mogelijk stress gemedieerde repressie onttrekken. Inderdaad, aanvankelijk gekarakteriseerd als een repressor van translatie vanwege het gebrek aan interactie met eIF4G ^12, eIF4E2 initieert de translatie van mRNAs die honderden RNA hypoxieresponselementen elementen in de 3 'UTR bevatten in hypoxische spanning ^6,13. Deze activering is bereikt door interactie met eIF4G3, RNA bindend eiwit motief 4, en de hypoxia induceerbare factor (HIF) 2α een hypoxische eIF4F complex of eIF4F ^{H 6,13} vormt. Als een repressor onder normale omstandigheden, eIF4E2 bindt met GIGYF2 en ZNF598 ^14. Deze complexen werden gedeeltelijk geïdentificeerd door middel van agarose-gekoppelde m ⁷ GTP affiniteitsharsen. Dit klassieke methode ¹⁵ is standaard op het gebied van vertaling en is de beste en meest gebruikte techniek om-cap bindende complexen te isoleren in pull-down en in vitro bindingstesten ^16-19. Als de cap-afhankelijke translatie machinerie is in opkomst als flexibel en aanpasbaar met inter-wisselende delen ^6-8,13, deze methode is een krachtig instrument om nieuwe-cap-bindende eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op stress snel kan identificeren. Bovendien verschillen in eIF4F kan grote gevolgen hebben als een aantal eukaryote modelsystemen blijken een eIF4E2 homoloog voor stressreacties zoals gebruikenals A. thaliana ^20, S. Pombe ^21, D. melanogaster ²² en ²³ C. elegans.

Er zijn aanwijzingen dat variaties in eIF4F niet strikt kan beperkt stresssituaties, maar worden in normale fysiologie ^24. De zuurstoftoevoer naar weefsels (at capillair uiteinden) of binnen weefsels (gemeten met micro-elektroden) varieert van 2-6% in de hersenen ^25, 3-12% in de longen ^26, 3,5-6% in de darm ^27, 4% in de lever ^28, 7-12% in de nier ^29, 4% in de spieren ³⁰ en 6-7% in het beenmerg ^31. Cellen en mitochondriën bevatten minder dan 1,3% zuurstof ^32. Deze waarden zijn veel dichter bij hypoxie dan de omgevingslucht wanneer cellen worden routinematig gekweekt. Dit suggereert dat wat eerder werd gezien als hypoxie-specifieke cellulaire processen betrokken in een fysiologische omgeving zijn. Interessant, eIF4F en eIF4F ^H </sup> actief deelnemen aan de translatie-initiatie van verschillende zwembaden of klassen van mRNA in verschillende menselijke cellijnen blootgesteld aan fysiologische zuurstof of "physioxia" ^24. Lage zuurstof rijdt ook een goede ontwikkeling van de foetus ³³ en cellen hebben in het algemeen een hogere proliferatie tarieven, langere levensduur, minder DNA-schade en minder algemene stressreacties in physioxia ^34. Daarom eIF4F ^H is waarschijnlijk een belangrijke factor in de expressie van geselecteerde genen onder fysiologische omstandigheden.

Hier bieden we een protocol om kweekcellen in vaste fysiologische zuurstofarme omstandigheden of in een dynamisch fluctuerende bereik dat waarschijnlijk meer representatief is voor het weefsel micro-omgevingen. Een voordeel van deze methode is dat de cellen worden gelyseerd in de hypoxie werkstation. Het is vaak niet duidelijk hoe de overgang van hypoxische celkweek cellysis wordt uitgevoerd in andere protocollen. De cellen worden vaak eerst verwijderd uit een klein hypoxie incubator wordenvoorgrond lysis, maar deze blootstelling aan zuurstof kunnen beïnvloeden biochemische pathways de cellulaire reactie op zuurstof snel (één of twee min) ^35. Bepaalde-cap-bindende eiwitten nodig interacties met een tweede base of kan de m ⁷ GTP, daarom enkele cap interactors kan worden gemist in het zuiveringsproces te hydrolyseren. -Agarose gebonden enzymatisch resistente cap analoga kunnen worden gesubstitueerd in dit protocol. Het verkennen van de activiteit en de samenstelling van eIF4F ^H en andere variaties van eIF4F door middel van de hier beschreven methode zal licht werpen op de ingewikkelde genexpressie machines dat cellen gebruiken tijdens fysiologische omstandigheden of stressreacties.