Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга
Summary
Протокол культуры от эксплантов мягкая и паутинная оболочки мозга человеческого мозга посмертных является технически надежный и простой способ получения фибронектин-позитивных менингеальных фибробласты в течение 6-8 недель и криоконсервируют около 20-30 миллионов клеток.
Abstract
Несмотря на то, значительный прогресс был достигнут в клинической характеристике болезни Паркинсона, некоторые исследования показывают, что диагноз болезни Паркинсона не патологически подтверждено в до 25% от болезни клинически диагностированных Паркинсона. Таким образом, ткань собрана из клинически диагностированных пациентов с идиопатической болезнью Паркинсона может иметь высокий уровень ошибочному диагнозу; следовательно , в пробирке исследования из таких тканей для изучения болезни Паркинсона как доклинические модель может стать бесполезной.
Собрав посмертных человека лептоменинкс с подтвержденным нейропатологического диагнозом болезни Паркинсона и характеризуется нигростриатной потерей клеток и внутриклеточных белковых включений называемые тельца Леви, можно быть уверенным , что клинически наблюдается паркинсонизм не вызывается другим основным процессом заболевания (например , опухоли, атеросклероз).
Этот протокол PresenТ.С. Вскрытие и подготовка посмертных человеческих лептоменинкс для дифференцирования менингеальной культуры фибробластов. Эта процедура является надежной и имеет высокий уровень успеха. Проблема культуры является стерильность, как заготовка головного мозга, как правило, не выполняется в стерильных условиях. Поэтому, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В.
Вывод менингеальных фибробластов из случаев аутопсии подтвержденных с болезнью Паркинсона, обеспечивает основу для моделирования в пробирке болезни Паркинсона. Менингеальные фибробласты появляются 3-9 дней после подготовки образца и около 20-30 миллионов клеток могут быть криоконсервации через 6-8 недель. Менингеальная культура фибробластов является однородным и клетки экспрессируют фибронектин, обычно используемый маркер для идентификации мозговых оболочек.
Introduction
Мозговые оболочки состоят из трех оболочек, которые защищают мозг: твердой мозговой оболочки, паутинной и мягкой мозговой оболочки. Совсем недавно было признано , что Оболочек также играют важную роль в развитии мозга и мозговой гомеостаз 1. Оболочках получены из мезенхимальных и нервного гребня полученных клеток и , что интересно, было показано , что клетки – предшественники , проживающих в оболочках могут привести к нейронов в пробирке и после трансплантации в естественных условиях 2, 3, 4. Оболочках культур были также с успехом использованы в качестве фидерных слоев, так как они обладают полученной из культур клеток , индуцирующих активность стромы для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в дофаминергические нейроны 5. Кроме того, есть мягкая и паутинная оболочки мозга потенциал непосредственно дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты при ишемии 6.
Для этого протокола, образцы посмертных Оболочек человека собирают из паутинной и мягкой мозговой оболочки, совместно именуемые лептоменинкс и закупаются в рамках донорства головного мозга человека в исследовательских целях. Препарирование мозга осуществляется в течение 24 ч после смерти и образец помещается мягкая и паутинная оболочки мозга в холодной питательной среды для дальнейшей обработки в течение ближайших 6-8 часов, как показано здесь, в этом протоколе.
Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка человеческих образцов мозговые оболочки для развития пациента первичных лептоменинкс культуре клеток. Ткань разрезали на 25-30 кусков приблизительно 3 мм х 3 мм квадратов. Три фигуры помещены в каждом 6-луночные покрытый желатином хорошо и удерживается с круглыми покровные стекла. Оболочек рассечение занимает около 25-35 мин. Основной задачей этой культуры является стерильность как мозг закупок, транспорта и рассечения, как правило, не производится в стерильных условиях. Therefore, важно, чтобы дополнить культуральные среды с коктейлем пенициллина, стрептомицина, и амфотерицином В и использовать мульти-луночных планшетах для культуры отдельно Куски ткани.
Вырост менингеальных фибробластов происходит обычно в течение первой недели. Медиа меняется каждые два-три дня, пока клетки не сливающийся и клетки ферментативно пассировать. Менингеальной фибробласты замораживают в 1 миллион клеток на мл / флакон в криоконсервации средах. С помощью этого протокола, 20-30 миллионов менингеальные фибробласты могут быть получены в течение 6-8 недель для криоконсервации. Downstream применения этих менингеальных фибробластов являются первичные культуры для исследования болезней, прямой дифференцировки нейронов или выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из лептоменинкс для понимания механизмов развития заболеваний, а также для разработки лекарственных средств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает простой и надежный протокол для получения оценки менингеальное культуры фибробластов из лептоменинкс посмертных человека, собранных в сочетании с пожертвованием мозга. Есть очень мало описания протоколов для получения клеточных культур из посмертного челов?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
