Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau
Summary
Le protocole de culture leptoméninge explant de post-mortem du cerveau humain est un moyen techniquement robuste et simple pour obtenir des fibroblastes méningées fibronectine positifs dans les 6-8 semaines et cryoconservation environ 20-30000000 cellules.
Abstract
Même si des progrès considérables ont été accomplis dans la caractérisation clinique de la maladie de Parkinson, de nombreuses études indiquent que le diagnostic de la maladie de Parkinson n'a pas pathologiquement confirmé dans jusqu'à 25% de la maladie de Parkinson diagnostiquée cliniquement. Par conséquent, les tissus prélevés chez des patients cliniquement diagnostiqués avec la maladie de Parkinson idiopathique peut avoir un taux élevé d'erreur de diagnostic; par conséquent , des études in vitro à partir de ces tissus pour étudier la maladie de Parkinson comme un modèle pré – clinique peut devenir inutile.
En recueillant leptoméninge humains post – mortem avec un diagnostic neuropathologique confirmé de la maladie de Parkinson et caractérisé par la perte de cellules nigro et inclusions protéiques intracellulaires appelées corps de Lewy, on peut être certain que le parkinsonisme cliniquement observé est pas causée par un autre processus pathologique sous – jacent (par exemple , la tumeur, l' artériosclérose).
Ce protocole présents la dissection et la préparation des leptoméninge humains post-mortem pour la dérivation d'une culture de fibroblastes méningée. Cette procédure est robuste et a un taux de réussite élevé. Le défi de la culture est la stérilité que l'acquisition du cerveau est généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Par conséquent, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B.
La dérivation des fibroblastes méningées des cas d' autopsie confirmés de la maladie de Parkinson est la base pour la modélisation in vitro de la maladie de Parkinson. fibroblastes méningées apparaissent 3-9 jours après la préparation des échantillons et environ 20-30 millions de cellules peuvent être cryoconservés dans 6-8 semaines. La culture de fibroblastes méningée est homogène et les cellules expriment la fibronectine, un marqueur couramment utilisé pour identifier les méninges.
Introduction
Méninges se composent de trois membranes qui protègent le cerveau: la dure-mère-mère, arachnoïde et la pie. Plus récemment, il a été reconnu que les méninges jouent également un rôle important dans le développement du cerveau et du cerveau homéostasie 1. Méninges sont dérivées de cellules mésenchymateuses et dérivées de la crête neurale et de façon intéressante, il a été démontré que les cellules souches résidant dans les méninges peuvent donner naissance à des neurones in vitro et in vivo après transplantation 2, 3, 4. Les cultures méninges ont également été utilisées avec succès en tant que couches d'alimentation, car ils possèdent une activité inductrice dérivé des cellules stromales de la différenciation des cellules souches embryonnaires dans des neurones dopaminergiques 5. En outre, les leptoméninges ont le potentiel de se différencier en neurones directement, les astrocytes, les oligodendrocytes et dans des conditions ischémiques 6.
Pour ce protocole, les échantillons de meninges post-mortem humaines sont collectées à partir de l'arachnoïde et la pie, collectivement appelées les méninges, et sont achetés dans le cadre d'un don de cerveau humain à des fins de recherche. Dissection du cerveau est effectué dans les 24 h de la mort et l'échantillon de leptoméninge est placé dans un milieu de croissance à froid pour un traitement ultérieur dans le 6-8 suivant h comme illustré ici dans ce protocole.
Ce protocole décrit la dissection et la préparation d'échantillons de méninges humaines pour le développement de la culture de cellules de leptoméninge primaires patient. Le tissu est découpé en morceaux d'environ 25-30 3 mm x 3 mm carrés. Trois pièces sont placées dans chaque 6 puits revêtues de gélatine bien et maintient avec des lamelles de verre rondes. La dissection meninges prend environ 25-35 min. Le principal défi de cette culture est la stérilité comme le cerveau l'approvisionnement, le transport, et la dissection ne sont généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Tonc, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B et en utilisant des plats multi-puits pour la culture séparément des morceaux de tissu.
Excroissance des fibroblastes méningés se produit généralement dans la première semaine. Le support est changé tous les deux à trois jours jusqu'à ce que les cellules soient confluentes et les cellules sont repiquées par voie enzymatique. Les fibroblastes méningées sont cryoconservés à 1 million de cellules par mL / flacon dans les milieux de cryoconservation. Avec ce protocole, 20-30 millions de fibroblastes méningées peuvent être dérivées en 6-8 semaines pour la cryoconservation. Les applications en aval de ces fibroblastes méningées sont des cultures primaires pour la recherche sur la maladie, la différenciation neuronale directe ou dérivation de cellules souches pluripotentes induites à partir de la leptoméninge pour la compréhension des mécanismes de la maladie et pour le développement de médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un protocole simple et robuste pour dériver une culture de fibroblastes méningée de leptoméninge post-mortem humains recueillies conjointement avec un don de cerveau. Il y a très peu de descriptions de protocoles pour dériver des cultures de cellules de matériel humain post-mortem. Deux études décrivent des cultures de fibroblastes 7, 8, peau dérivé 9, une étude décrit les échantillons <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
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References
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