الاشتقاق الثقافات السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الجهات المانحة الدماغ البشري
Summary
بروتوكول ثقافة السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الإنسان الدماغ هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص الخلايا الليفية السحائية-الفيبرونكتين إيجابية في غضون 6-8 أسابيع وcryopreserve ما يقرب من 20 حتي 30000000 الخلايا.
Abstract
على الرغم من إحراز تقدم كبير في توصيف السريري لمرض الشلل الرعاش، وتفيد العديد من الدراسات أن تشخيص مرض باركنسون لم يتأكد بشكل مرضي في ما يصل إلى 25٪ من تشخيص المرض سريريا باركنسون. لذلك، الأنسجة التي تم جمعها من المرضى الذين شخصت سريريا مع مرض مجهول السبب باركنسون يمكن أن يكون ارتفاع معدل خطأ في التشخيص. وبالتالي في الدراسات المختبرية من هذه الأنسجة لدراسة مرض باركنسون كنموذج قبل السريرية يمكن أن تصبح غير مجدية.
من خلال جمع السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة مع تشخيص عصبية مرضية مؤكدة بمرض باركنسون وتميزت فقدان الخلية السوداوي المخططي والادراج البروتين داخل الخلايا تسمى الهيئات ليوي، يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن الرعاش وحظ سريريا لا ينتج عن عملية المرض الكامنة أخرى (مثل الورم، وتصلب الشرايين).
هذا presen بروتوكولنهاية الخبر تشريح وإعداد السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية السحائية. هذا الإجراء هو قوي ولديه نسبة نجاح عالية. التحدي المتمثل في الثقافة هو العقم كما هو عادة يتم تنفيذ شراء الدماغ تحت ظروف معقمة. وبالتالي، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، وأمفوتيريسين B.
اشتقاق الخلايا الليفية السحائية من حالات التشريح المؤكدة بمرض باركنسون يوفر الأساس لفي المختبر نماذج من مرض الشلل الرعاش. تظهر الخلايا الليفية سحائي بعد 3-9 أيام إعداد العينات وحوالي 20-30 مليون خلية يمكن cryopreserved في 6-8 أسابيع. ثقافة الخلايا الليفية السحائية هي متجانسة والخلايا تعبر عن فبرونيكتين، علامة تستخدم عادة لتحديد السحايا.
Introduction
تتكون السحايا من ثلاثة أغشية التي تحمي الدماغ: الأم الجافية، العنكبوتية والأم الحنون. وفي الآونة الأخيرة، تم الاعتراف بأن السحايا أيضا أن تلعب دورا هاما في نمو الدماغ والمخ التوازن 1. وتستمد السحايا من الوسيطة والخلايا المشتقة من قمة العصبية والمثير للاهتمام، فقد تبين أن الخلايا السلف المقيمين في السحايا يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية في المختبر، وبعد زرع في الجسم الحي 2، 3، 4. كما استخدمت الثقافات السحايا بنجاح كما طبقات المغذية، كما أنها تمتلك انسجة المشتقة من خلية النشاط على حث لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الدوبامين 5. وعلاوة على ذلك، السحايا الرقيقة لديها القدرة على التفريق مباشرة إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في ظل ظروف الدماغية 6.
لهذا البروتوكول، يتم جمع عينات السحايا بعد الوفاة البشرية من أم عنكبوتية والحنون، مجتمعة تسمى السحايا الرقيقة، ويتم شراؤها كجزء من التبرع الدماغ البشري لأغراض البحث. يتم إجراء تشريح الدماغ خلال 24 ساعة من وفاة ويتم وضع عينة السحايا الرقيقة في وسائل الإعلام نمو البارد لمزيد من المعالجة ضمن ح 6-8 القادمة كما هو موضح هنا في هذا البروتوكول.
يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد العينات السحايا الإنسان لتطوير زراعة الخلايا السحايا الرقيقة الأولية للمرضى. يتم قطع الأنسجة إلى 25-30 قطعة من حوالي 3 ملم × 3 مربعات ملم. وضعت ثلاث قطع في كل جيدا 6 جيدا والاحتفاظ باستمرار مع coverslips الزجاج ذهابا والجيلاتين المغلفة. تشريح السحايا يستغرق حوالي 25-35 دقيقة. ويتمثل التحدي الرئيسي مع هذه الثقافة بشكل عام يتم تنفيذ معقمة وشراء الدماغ، والنقل، وتشريح تحت ظروف معقمة. تherefore، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، والأمفوتريسين B واستخدام أطباق متعددة جيدا لحدة قطعة نسيج الثقافة.
ثمرة من الخلايا الليفية السحائية يحدث عادة في غضون الأسبوع الأول. يتم تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام حتى الخلايا هي متكدسة وو passaged الخلايا إنزيمي. والخلايا الليفية السحائية هي cryopreserved من 1 مليون خلية لكل مليلتر / قارورة في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. مع هذا البروتوكول، 20-30000000 الليفية سحائي يمكن أن تستمد في 6-8 أسابيع لحفظ البرودة. تطبيقات المصب من هذه الخلايا الليفية السحائية هي الثقافات الأولية للبحوث الأمراض، تمايز الخلايا العصبية المباشر أو اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من السحايا الرقيقة لفهم آليات المرض وتطوير الأدوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول بروتوكول بسيط وقوي لاستخلاص الثقافة الليفية السحائية من السحايا الرقيقة تشريح الإنسان جمعها بالتزامن مع هبة الدماغ. هناك عدد قليل جدا من أوصاف بروتوكولات لاستخلاص مزارع الخلايا من المواد البشرية بعد الوفاة. تصف دراستين الجلد المستمدة الثقافات ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
