死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出
Summary
人間の死後脳から軟膜外植片培養プロトコルは6-8週間以内にフィブロネクチン陽性髄膜線維芽細胞を導出し、約20から30000000細胞を凍結保存するための技術的に堅牢かつ簡単な方法です。
Abstract
大きな進歩は、パーキンソン病の臨床的特徴付けてなされたものであっても、いくつかの研究は、パーキンソン病の診断は病理学的に、臨床的に診断されたパーキンソン病の25％までで確認されていないことを報告しています。したがって、特発性パーキンソン病と臨床的に診断された患者から採取した組織は、誤診率の高さを持つことができます。したがって、前臨床モデルとして、パーキンソン病を研究するために、このような組織からのin vitro試験で無駄になることができます。
パーキンソン病の確認神経病理学的診断と死後の人間の軟膜を収集し、黒質線条体細胞損失およびレビー小体と呼ばれる細胞内タンパク質封入体によって特徴づけられることで、1は、臨床的に観察されたパーキンソニズムは、他の基礎疾患プロセス（ 例えば、腫瘍、動脈硬化症）によって引き起こされていないことを確信することができます。
このプロトコルPRESEN髄膜線維芽細胞培養の導出のための死後の人間の軟膜の解剖と準備TS。この手順は、堅牢であり、高い成功率を有します。脳の調達は、一般的に無菌条件下で行われていないとして、文化の課題は、無菌性です。従って、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンBのカクテルで培地を補充することが重要です
パーキンソン病の剖検で確認例から髄膜線維芽細胞の導出は、パーキンソン病のin vitroモデル化のための基盤を提供します。髄膜線維芽細胞は3-9日、試料調製後に表示され、約20〜30万個の細胞を6〜8週間で凍結保存することができます。髄膜線維芽細胞培養物は、均質であり、細胞は、フィブロネクチン、髄膜を識別するために一般的に使用されるマーカーを発現します。
Introduction
硬膜、くも膜と軟膜：髄膜は脳を保護する3膜で構成されています。より最近には、髄膜も脳の発達と脳のホメオスタシス1で重要な役割を果たすことが認識されています。髄膜は、間葉系および神経堤由来細胞から誘導され、興味深いことに、髄膜内に存在する前駆細胞は、in vitroおよびin vivo 2、3、4 における移植後の神経細胞を生じさせることができることが示されています。それらはドーパミン作動性ニューロン5に、胚性幹細胞の分化のための間質細胞由来誘導活性を有するような髄膜培養物はまた、成功裏に、フィーダー層として使用されてきました。また、軟膜は直接虚血状態6の下で、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する能力を持っています。
このプロトコルでは、人間の死後髄膜サンプルをまとめて、くも膜と軟膜から収集された軟膜と呼ばれ、研究目的のために人間の脳の寄付金の一部として調達されています。脳の解剖死の24時間以内に行われ、このプロトコルでここに示されているように軟膜サンプルは、次の6~8時間以内にさらなる処理のために冷増殖培地中に置かれます。
このプロトコルは、患者の一次軟膜細胞培養の開発のための解剖と人間の髄膜試料の調製を記載します。組織は、約3ミリメートル×3ミリメートルの正方形の25-30片に切断されています。三枚は各6ウェルに配置されたゼラチンでコーティングされたウェルと丸いガラスカバースリップでダウンして開催されました。髄膜切開は、約25-35分かかります。この文化の主な課題は、脳の調達、輸送、および解剖などの無菌性は、一般的に無菌条件下で行われていないです。 Therefore、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンBのカクテルで培地を補足し、別々に培養組織片にマルチウェルディッシュを使用することが重要です。
髄膜線維芽細胞の増殖は、最初の週以内に通常発生します。細胞がコンフルエントになるまで培地を2〜3日ごとに変化させ、細胞を酵素的に継代します。髄膜線維芽細胞は、凍結保存培地mLの/バイアルあたり100万個の細胞で凍結保存します。このプロトコルでは、20から30000000髄膜線維芽細胞は、凍結保存のため6-8週間で導出することができます。これらの髄膜線維芽細胞の下流のアプリケーションが、疾患の研究、直接神経分化または病気のメカニズムの理解のため、および薬物開発のための軟膜から誘導された多能性幹細胞の誘導のための一次培養物です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、脳の寄付金と合わせて採取したヒト死後の軟膜から髄膜線維芽細胞培養を導出するためのシンプルかつ堅牢なプロトコルを記述します。死後の人間の材料から細胞培養物を導出するプロトコルの非常にいくつかの説明があります。二つの研究は、皮膚由来線維芽細胞培養物7を説明する 8、9、</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
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References
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