مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي
Summary
Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Abstract
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Introduction
عيوب في الغضروف المفصلي لا تلتئم بشكل طبيعي. ونتيجة لذلك، وقف وقد اقترح زرع الخلايا كنهج واعدة لإصلاح الغضروف ضعف. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب على حد سواء الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية وتحريض هذه الخلايا على الخضوع التمايز المولدة للغضروف. نخاع العظم (BM) وقد استخدم على نطاق واسع كمصدر للخلايا الجذعية، لكن العزلة خلية من BM اثنين من عيوب رئيسية هي: الغزو وعدم كفاية العائد. بسبب سهولة اقتناء والأنسجة الدهنية مصدرا مفضلا للخلايا الجذعية. وأظهرت دراسات سابقة إمكانية عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الدهنية ويحفز التمايز المولدة للغضروف في هذه الخلايا باستخدام السيتوكينات، مثل TGF-β1 1 و 2. هذه الطرق فعالة لكنها باهظة الثمن.
باعتبارها أقل تكلفة البديل لالسيتوكينات، إجهاد يمكن استخدامها للحث على تمايز المولدة للغضروف. تحميل الميكانيكية يلعب دورا حاسما في الحفاظ على صحة الغضروف المفصلي 3، ويمكن أن تحدث الظواهر المولدة للغضروف في خلايا مختلفة. على سبيل المثال، الضغط الهيدروليكي يدفع الظواهر المولدة للغضروف في الخلايا الاولية المستمدة من الغشاء الزليلي عبر خطة عمل البحر المتوسط كيناز / JNK مسار 4، والضغط الميكانيكي يدفع تكون الغضروف في الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) من خلال upregulating الجينات chondrocytic 5. وبالإضافة إلى ذلك، إجهاد القص يساهم في التعبير عن ذات الصلة تكون الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) في اللجان الدائمة الإنسان 6. خطورة الطرد المركزي (م)، وإجهاد تطبيقها بسهولة والتحكم التي تم إنشاؤها بواسطة الطرد المركزي، يمكن أن تحفز التعبير الجيني الفرق في الخلايا 7. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الرئة الظهارية، وupregulated التعبير عن انترلوكين (IL) -1b بواسطة الطرد المركزي 8. تيherefore، باعتبارها إجهاد محرض تجريبيا، CG يمكن أن تستخدم للحث على التعبير الجيني chondrocytic في الخلايا الجذعية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت CG يمكن أن تحفز على تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف.
في هذه الدراسة، وجدنا أن CG يسببها upregulation من SOX9، المنظم الرئيسي لتكون الغضروف، في مخولا لصيانة طائرات الإنسان، مما أدى إلى overexpression من الجينات chondrocytic. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا مقارنة آثار CG على الغضروف مع تلك TGF-β1، وعامل النمو الأكثر شيوعا للحث في المختبر تكون الغضروف في الخلايا الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدولة stemness الخلايا مهمة جدا ل overexpression الناجم عن CG-من SOX9. في دراستنا، يمكن أن يتسبب التعبير SOX9 التي كتبها CG في مخولا لصيانة طائرات المبكر مرور (2-3)، ولكن ليس في مخولا لصيانة طائرات في وقت لاحق-مرور. وقد أفيد أنه خلال زراعة، مخولا لصيانة طائرات تحتوي على CD34 + الخلايا حتى 3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).
