Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon
Summary
Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Abstract
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Introduction
eklem kıkırdağında Kusur doğal iyileşmek yok. Sonuç olarak, hücre transplantasyonu bozulmuş kıkırdak tamiri için umut verici bir yaklaşım olarak önerilmiştir kaynaklanıyor. Bununla birlikte, bu yöntem, bir kök hücre, yeterli sayıda elde edilmesi ve kondrojenik farklılaşma geçmesi bu hücrelerin uyarılmasını gerektirir. Kemik iliği (BM), yaygın olarak, kök hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak BM hücre izolasyonu, iki önemli dezavantajı vardır: invaziv ve yetersiz verim. Çünkü satın kolaylığı nedeniyle, yağ dokusu, kök hücrelerin tercih edilen kaynağıdır. Daha önceki çalışmalar, adipoz dokusundan kök hücrelerin izole edilmesi ve TGF-ß1 1, 2 gibi sitokinler kullanılarak bu hücrelerde kondrojenik farklılaşmasını uyaran uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Bu yöntemler etkili ama pahalı.
sitokinler için daha düşük bir ekonomik alternatif olarak, mekanik strese kullanılabilirkondrojenik farklılaşmasını indükler. Mekanik yükleme eklem kıkırdağı 3 sağlığını korumada önemli bir rol oynar, ve çeşitli hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olabilir. Örneğin, hidrostatik basınç MAP kinaz / JNK yolunun 4 üzerinden sinovya kaynaklı progenitör hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olur ve mekanik sıkıştırma kondrositik genleri 5 regülasyonunda insan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) 'de kondrojenezi neden olur. Buna ek olarak, kayma gerilmesi insan MSC 6 kondrogenezis ilgili ekstrasellüler matriks (ECM) ifadesi katkıda bulunur. Santrifüj ağırlığı (CG), santrifüj ile üretilen bir kolaylıkla uygulanabilen ve kontrollü mekanik stres, hücre 7 farklı gen ifadesini endükleyebilen. Örneğin, akciğer epitelyal karsinom hücrelerinde, interlökin (IL) -1b sentezlenmesi santrifüj 8 ile üst-düzenlenmektedir. Therefore, deneysel olarak uyanlabilir mekanik stres, CG kök hücrelerdeki kondrositik, gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir. Ancak, CG kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını teşvik edip belirsizliğini koruyor.
Bu çalışmada, CG kondrositik genlerin tanımlanması sonuçlanan insan TSK olarak, SOX9 uyarılması, kondrojenez bir ana regülatör neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, TGF-ß1 olanlar ile kondrojenez CG etkileri, büyüme faktörü en çok kök hücrelerin in vitro kondrojenezi indüklemek için kullanılan göre.
Protocol
Representative Results
Discussion
hücrelerin stemness durumu SOX9 CG indüklenen aşırı ekspresyonu için çok önemlidir. Bizim çalışmamızda, SOX9 sentezleme ancak sonraki geçiti TSK, erken geçit TSK (2-3) 'de CG neden olabilir. Yetiştirilmesi sırasında, TSK 3 pasajlar 16 kadar, CD34 + hücreleri içermektedir, bildirilmiştir. TSK hücreleri CG düşük bir yanıt elde geçişli olarak CD34 ifadesini kaybetmek eğilimindedir.
merkezkaç yerçekimi kuvveti ile, hidrostatik basınç CG…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).
