La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga
Summary
Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Abstract
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Introduction
Los defectos en el cartílago articular no se curan de forma natural. En consecuencia, trasplante de células madre ha sido propuesta como un enfoque prometedor para la reparación de cartílago deteriorado. Sin embargo, este método requiere tanto la adquisición de un número suficiente de células madre y la inducción de estas células a someterse a la diferenciación condrogénica. La médula ósea (BM) se ha usado ampliamente como una fuente de células madre, pero el aislamiento de células de BM tiene dos desventajas principales: invasión y de rendimiento insuficiente. Debido a su facilidad de adquisición, el tejido adiposo es una fuente preferida de células madre. Estudios previos demostraron la factibilidad de aislamiento de células madre a partir de tejido adiposo y la inducción de la diferenciación condrogénica en estas células por medio de citocinas, tales como TGF-β1 1, 2. Estos métodos son eficaces, pero caro.
Como una alternativa de bajo costo para las citoquinas, la tensión mecánica se puede utilizar parainducir la diferenciación condrogénica. Carga mecánica juega un papel crítico en el mantenimiento de la salud del cartílago articular 3, y que puede inducir fenotipos condrogénicas en diversas células. Por ejemplo, la presión hidrostática induce fenotipos condrogénicas en las células progenitoras sinovial derivado a través de la vía de la MAP quinasa / JNK 4, y la compresión mecánica induce condrogénesis en células madre mesenquimales humanas (MSCs) upregulating genes chondrocytic 5. Además, la tensión de cizallamiento contribuye a la expresión de la matriz extracelular relacionados condrogénesis-(ECM), en MSC humanas 6. Gravedad centrífuga (CG), una tensión mecánica fácilmente aplicada y controlada generada por centrifugación, se puede inducir la expresión génica diferencial en las células 7. Por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón epiteliales, la expresión de la interleucina 1b (IL) es upregulated por centrifugación 8. Tor lo tanto, como una tensión mecánica experimentalmente inducible, CG se puede utilizar para inducir la expresión de genes en las células madre chondrocytic. Sin embargo, no queda claro si CG puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre.
En este estudio, se encontró que CG indujo la regulación al alza de SOX9, un regulador maestro de la condrogénesis, en ASC humanos, dando como resultado la sobreexpresión de los genes chondrocytic. Además, se compararon los efectos de CG en la condrogénesis con las de TGF-β1, el factor de crecimiento más comúnmente utilizado para inducir la condrogénesis in vitro en las células madre.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estado stemness de las células es muy importante para la sobreexpresión inducida por CG de SOX9. En nuestro estudio, la expresión SOX9 podría ser inducida por CG en ASC-paso temprano (2-3), pero no en ASC-tarde de paso. Se ha informado de que, durante el cultivo, ASC contienen CD34 + células hasta 3 pasajes 16. ASCs tienden a perder la expresión de CD34 como se pasan las células, lo que resulta en una baja respuesta a CG.
Con la fuerza de gravedad centrífug…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
References
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