Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge
Summary
Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.
Abstract
Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.
Introduction
Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d'isoler des cellules souches du tissu adipeux et d' induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 1, 2. Ces méthodes sont efficaces mais coûteux.
Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire 3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK 4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes 5 chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l'expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines 6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l' expression différentielle des gènes dans les cellules 7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l' épithélium du poumon, l'expression de l' interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation 8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l'expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches.
Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50ug/ml |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50ug/ml |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate |
Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
References
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