Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Tüm hayvan deneyleri NIAID Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı LIG-4 hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Reaktiflerin 1. Hazırlık Manyetik ayırma (MS) tamponu hazırlayın:% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.5 BSA ile takviye edilmiş, otomatik ayırma çözeltisi ile takviye edilmiş PBS (pH 7.2). 2-8 ° C'de steril filtre (0.22 um) ve mağaza. RF10 orta hazırlayın: RPMI 1640 ortam,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 50 U / ml penisilin, 50 uM streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş 50 uM 2 p-merkaptoetanol, 10 mM HEPES. Steril reaktif kullanın. 2-8 ° C'de steril filtre ve mağaza. 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 25 mM glukoz ile desteklenmiş XF taban ortamı: mitokondriyal stres testi hazırlarlar. glikoliz stres testi ortamı hazırlayın: XF taban orta supplemen2 mM L-glutamin ile ted. 2-8 ° C'de 7.4, steril filtre ve mağaza için mitokondriyal ve glikoliz stres testi medya hem de pH ayarlayın. kullanım (37 ° C'de pH ölçümleri yürütmek) önce 37 ° C ve sıcak ortam pH'ı yeniden ayarlayın. Not: XF ortamının kullanılması, bikarbonat yoksun önemlidir. Hücre dışı akı analizörü atmosfer sadece ortam CO 2 içerdiğinden, orta herhangi bikarbonat, glikoliz bir yan ürünü olarak piyasaya proton bağlanması üzerine CO 2 ve su oluşturur ayırmak olacaktır. CO 2 olacak glikolitik asitlenme sinyalini belirsiz olacağını pH sürükleniyor neden deney sırasında gazdan arındırın. oligomycin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C'de saklayın. 2,4-DNP hazırlayın: DMSO 1 M stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C'de saklayın. antimisin hazırlayın: 10 mm DMSO stok çözeltisi hazırlayın; -20 ° C'de saklayın. rotenone hazırlayın: 10 mM s hazırlayınDMSO içinde tak solüsyonu; -20 ° C'de saklayın. glikoz hazırlayın: 250 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres testi ortamında glukozu eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. 2-DG hazırlayın: 500 mM çözelti oluşturmak üzere glikoliz stres test ortamında 2-DG katı eritin; Her deneyden önce taze hazırlamak ve donma yok. 2. fareler ile Hasat dalak ve lenf düğümlerinde Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma fare Euthanize. % 70 etanol ile fare püskürtün. sonraki T hücre izolasyonu için, dalak, yüzeysel servikal, yüzeysel / derin aksiller, çene, kasık ve mezenterik lenf düğümleri hasat. sonraki B hücre izolasyonu için, hasat sadece dalak. NOT: Bir biyogüvenlik kabini kullanın ve işleme kadar buz üzerinde PBS veya RF10 medyada hasat organları tutmak. tüm işlem ve isol için steril laboratuar aletlerinin ve steril tekniği kullanıntirme adımlar. izolasyon verimliliğini artırmak ve hücre ölümünü azaltmak için buz üzerinde tüm tamponları ve medya tutun. 3. Doku İşleme 50 ml'lik konik bir tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgeç yerleştirin ve süzgeç üzerine organları aktarın. T hücre izolasyonu için, tüm organları birleştirmek ve B hücre izolasyonu transferi sadece dalak için. steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecinden doku ezin. ezme esnasında, filtre ve organlar her zaman nemli olduğundan emin olun ve MS tampon ekleyerek gerektirdiği gibi onları ıslatın. Bu, hem yüksek hücre viyabilitesini tutmak ve filtrenin tıkanmasını engeller. ezme sonra, 5-10 uygulamak ml MS hücre kurtarma artırmak için filtreye tampon. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de süspansiyon santrifüjleyin. (Belirtilmedikçe, bu koşullar altında diğer tüm santrüfüj yürütmek). Sıvı süzün ve 5 mi ACK alyuvar lisiz tamponu içinde tekrar süspansiyon pelet. incuBuz üzerinde 5 dakika boyunca kesmek (bunlar manyetik ayırma ile müdahale için kırmızı kan hücreleri kaldırılması gerekir), kırmızı kan hücreleri lize etmek için. 10-20 ekle ml MS tampon ve santrifüj. 1 ml MS tamponu (eritrosit lizis enkaz kaldırmak bu filtrasyon) ile 15 ml konik tüp üzerinde 30 mikron hücre filtresi yerleştirin ve prime. santrifüj tüpten çıkan sıvı tortusundan ayırma, tampon ve filtre içinden geçmek 5 mi MS pelet tekrar süspansiyon. Hücre kurtarma artırmak ve filtreyi durulayın bu kullanmak için 4 ml MS tamponu ile ilk tüp yıkayın. Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı, hücrelerin toplam sayısını belirler. Bu hücre sayısı, splenositler daha sonra hücre dışı akı deneyinde kullanılacak ise, Bölüm 4'te gerekli manyetik ayırma reaktifleri miktarının belirlenmesi için kullanılan bu zamanda hücrelerin uygun sayıda kenara olacaktır. süspansiyon Santrifüj ve manyetik ayırma geçin. Süspanse Splenositler kullanılmazve 5 ml RF10 B hücre izolasyonu için hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde tutmak. B hücreleri ve naif CD4 + T hücrelerinin 4. Manyetik Ayırma biyotin-antikor kokteyli, anti-biyotin mikro-ve MS tampon gerekli hacimleri belirler. Bir kılavuz olarak 10 8 hücreleri için aşağıdaki miktarlar kullanın ve büyütmek ya da gerektiğinde aşağı. Not: bir buzdolabında çok buz üzerinde daha antikor bağlanma etkinliği ve daha uzun inkübasyon süreleri gerekli olabilir azaltabilir buz üzerinde inkübe yana örnekleri inkübe edin. Naif CD4 + T hücre ayrılması için reaktifler 10 8 hücreleri için hacim (uygun ölçek) Biotin-antikor kokteyli 100 ul birinci kuluçkalamada MS tamponu 400 ul Anti-biyotin mikro- 200 ul CD44 mikroboncuklarının 100 ul ikinci inkübasyon için MS tampon 200 ul 5 dakika boyunca 4 ° C 'de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. anti-biyotin mikroboncukları, CD44 mikroboncukları ekleme MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Tablo 1: T hücre izolasyonu hacimleri ve talimatlar. B hücre ayrılması için reaktifler 10 8 hücreleri için hacim (uygun ölçek) Biotin-antikor kokteyli </td> 100 ul birinci kuluçkalamada MS tamponu 400 ul Anti-biyotin mikro- 200 ul ikinci inkübasyon için MS tampon 300 ul 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, biyotin-antikor kokteyli ve hücreler inkübe edin. biyotin-antikor kokteyli ve MS tamponu uygun hacimde ekleyin ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de karışım inkübe edin. anti-biyotin mikroboncuk uygun hacimde ilave edin ve MS tamponu ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de karışım inkübe edin. ikinci bir inkübasyondan sonra, MS tamponu ve santrifüj ile tüp doldurun. Tablo 2: B hücre izolasyon hacimleri ve talimatlar. MS tamponu pelletini: el ayrılması için 500 ul, otomatik ayırma 3-4 ml. manuel veya otomatik ayrımları ya devamaşağıdaki gibi: Manuel Ayırma: 3 mi MS tamponu ile yıkanarak akışı ve asal kolon toplamak için aşağıdaki steril bir 15 ml konik bir tüp yerleştirmek ayırma mıknatıs bir LS sütun ekle. akış atmak. astarlanmış LS sütun hücre süspansiyonu aktarın ve geçmesine izin; MS tampon ve aynı zamanda sütun üzerinden bu geçiş 3 ml inkübasyon sırasında kullanılan tüp yıkayın. Eluat saflaştırılmış hücreleri içerir. B hücre izolasyonu için, yeni bir 15 ml tüp içine sütunu içinden ikinci kez saflaştırılmış hücreleri geçer ve yıkama adımı tekrar edin. Bu saflık ve verim artacaktır. Otomatik Ayırma: Otomatik separatör açın ve tampon çalışan solüsyonu ve% 70 Etanol durulama düzeylerini kontrol edin. Atık ayırma başlamadan önce boş olduğundan emin olun. t tüp boyutuna bağlı olarak uygun soğutulmuş raf seçinO saflaştırılmamış örneği (örneğin, 15 mi). ayırma süreci boyunca canlı hücreleri tutmak için, daha önce 3-4 saat boyunca 2-8 ° C'de soğutulmuş olan rafları kullanın veya kadar soğutucu katı hale gelir. Otomatik ayırıcı örnek sahnede soğutulmuş raf monte edin. yuva A1, yuva B1 olumsuz kısmı için bir tüp içinde örnek tüp, ve C1 pozitif kısmı için bir tüp yerleştirin. Birden fazla numune toplama, bir sonraki sütunlara (A2, B2, C2, vb) ilave tüpleri. dokunmatik ekranda ayırma sekmesini seçin ve raf tüplerin düzenlemeyi göstermektedir. ayırma menüsünden, "tüketir" programı seçin ve yıkama uygun tip programı döngüsünü tamamlamak (aşağıdaki nota bakınız). NOT: "tüketir" programı saflığı ön planda makinenin en hassas modunu kullanarak tükenmesi yürütmektedir. Buna ek olarak, üç farklı yıkama seçeneği vardır: quic, Durulama durulayın ve uyku k. Numuneler aynı kaynaktan gelen ve kombine edilecekse, hızlı durulama seçin. Numuneler ayrı tutulması ise, durulama seçin. başka izolasyonlar o gün yapılacaktır eğer uyku seçeneği seçin ve makine izolasyonu aşağıdaki kapatılacak eğer "Çalıştır" tuşuna basarak izolasyon başlatın ve istendiğinde tampon seviyelerini onaylayın. Program sona erdikten sonra, negatif fraksiyon saflaştırılmış hücreler içerir. MS tampon ve santrifüj ile 15 ml konik tüp kadar doldurun. MS tampon ve tekrar süspansiyon hücreleri 5 ml RF10 medyada süzün. Hücre dışı akı analize kadar buz üzerinde hücreleri tutun. NOT: İdeal olarak, hücre dışı akı tahlil izolasyon hemen sonra yapılmalıdır. Ancak, ön deneylerde deney sonuçlarında önemli bir fark taze olarak yalıtılmış olanlar karşı tecrit 3 saat içinde kullanılan hücrelerde gözlendi. <p claP = "jove_title"> 5. Hücre dışı Akı Deneyi Not: burada açıklanan protokol aracının 96 oyuklu bir formatta içindir. Başka bir biçim kullanılırsa Ciltler ayarlanması gerekir. Sensör Kartuşu hidrasyon kalibrant çözeltide sensörleri daldırarak, sensör kartuşunu yukarı kaldırın kalibrant çözeltisi 200 ul yarar plakanın Her çukurun dolgu ve yardımcı plaka üzerine sensör kartuşu indirin. NOT: kalibrant çözüm seviyesi batık sensörleri tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun. Kartuş her bir kuyu için O 2 ve H + ilişkili florofor limanlar; bunları düzgün çalışması için, bu sırayla hidre edilmesi gerekir. Olup CO2 veya oksijen / azot ile desteklenmiş 37 ° C kuluçka makinesi içinde kartuşu yerleştirin. belirtilmediği sürece, bu koşullar altında diğer tüm inkubasyon yürütmek. nemlendirmek için gece kartuşu inkübe edin. preparYapışkan kaplı plakalar arasında ation 0.1 M sodyum bikarbonat içinde 22.4 ug / ml yapışkan çözeltinin 2.5 mi hazırlanması, pH 8.0 (bikarbonat yapıştırıcı adsorpsiyonu için uygun pH sağlar). deney plakasının her oyuğuna çözeltisi 25 ul uygulanır ve 20 dakika için oda sıcaklığında tezgah üzerinde inkübe edin. Aspire yapıştırıcı ve her bir yıkama iki steril su, 200 ul kullanılmıştır. kuyular hücrelerin ekim önce kuruyana kadar bekleyin. Yapışkan kaplı plakalar hücreleri tohumlama 5 dakika boyunca 200 x g'de oda sıcaklığında santrifüje hücreleri. Uygun tahlil ortamı, 5 ml içinde süspanse hücreleri (mitokondriyal stresi ve glukoz gerilme ortam formülasyonu için yukarıya bakınız). deney ortamı istenen konsantrasyonda Santrifüj tekrar hücreleri ve tekrar süspansiyon (tabanda hacmi konsantrasyonuna göre değişir, her kuyu hücre süspansiyonu 180 ul içerecektir). NOT: Uygun tahlil medya ve bileşik süreces dışı akı analizörü aynı anda aynı plaka üzerinde mitokondriyal ve glikoliz stres testleri çalıştırabilirsiniz kullanılmaktadır. her bir hücre süspansiyonu 180 ul Plate. arkaplan sıcaklık düzeltmesi için kuyu A1, A12, H1 ve H12 kullanın: bu kuyulardan (hiçbir hücreleri) deney ortamı 180 ul ekleyin. 37 ° C'de 25 dakika süreyle inkübe edin. Tüm hücreler tam takılı olmasını sağlamak için hiçbir fren ile 5 dakika boyunca 200 xg'de plaka santrifüj. Görme hücreleri stabil mikroskop altında görüntüleyerek, bir tek tabaka oluşturan, kültür yüzeye yapışık olduğunu doğrulamaktadır. ilave bir 30 dakika boyunca geri plakaları aktarın. Bileşiklerin 10x Konsantrasyonlarına hazırlanması ve Enjektör Limanlar Yükleme mitokondriyal stres testi için, 10 uM oligomycin, 1mM DNP ve mitokondriyal stresi deney Mediu'nun 10 uM rotenone ve 10 uM antimisin, her bir karışımının her bir 2.5 mL hazırlanmasım. Not: 2,4-DNP konsantrasyonu, daha önce yayınlanan çalışmalara dayanmaktadır; 21, bu genel bir kural olarak, ancak bir araştırmacı tarafından belirlenmelidir kullanılan her hücre tipi için uncoupler konsantrasyonudur. glikoliz stres testi için, 2.5 mi, 250 mM glukoz, 10 uM oligomycin ve glikoliz gerilme deney ortamı içinde 500 mM 2-deoksiglukoz (2-DG) her hazırlanması. Sıcak 10x 37 ° C solüsyon ve pH 7.4 ayarlanır. aşağıdaki gibi bir çok kanallı micropipettor ve yükleme kılavuzları kullanarak kartuşun uygun enjektör portlarına bileşikleri yükleyin: Liman Mitokondriyal Stres Testi Glikoliz Stres Testi bir 20 ul oligomycin 20 ul glukoz B 22 ul 2,4-DNP 22 ul oligomycin C 25 ul antimisin / rotenon 25 p, l 2-DG Tablo 3: Bileşik hacimleri. NOT: portların Her dizi (örneğin, tüm bağlantı noktaları A) aynı ses içermelidir. (Kullanılmayan kuyularda port deney ortamı ile aynı hacmi ile yüklenebilir) olarak bileşimleri enjekte edilmez, belirli bir seriye ait tüm kaynaklar, daha deneyde kullanılan olmayanlar yüklü çok önemlidir. Programı kurarken kartuşu kuluçkaya yatmaktadır. Ekstraselüler Akı Deneyi Protokolleri Kurma Aşağıdaki programı (Tablo 4) ayarlayın. Adım döngü </tr> ayarlama – Dengeleme – Baseline okumalar 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin bitiş döngü – Liman A enjekte – ölçümler 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin bitiş döngü – Liman B enjekte – ölçümler 3 kez: Tedbir, 3 dakika, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyin bitiş döngü – Liman C enjekte – ölçümler 3 kez: MEASUR, 3 dakika karıştırın 0 dakika bekleyinE 3 dakika bitiş döngü – bitiş Programı – Tablo 4: Program düzeni. Not: aktif hücreleri kullanıldığında, belirli koşullar altında, örneğin, asidifikasyon saf hücrelerde daha uzun bir süre devam edebilir. Bu nedenle, her ölçüm döngüsü kez daha yukarıdaki programda "bekle" süresini uzatmak veya tekrar etmek gerekebilir. Program başlar. (Istendiğinde) kalibrasyon adımından sonra, tahlil plaka için kalibrant plakasını değiştirin. Not Yazılımı kullanılarak, benzer koşullar kuyularda gruplarını işaret etmek mümkündür. Buna ek olarak, kontrol oyukları olan kuyu göstermek için çok önemlidir (Bu protokol, bu plaka, dört köşe) ve boş olan kuyu gösterir. Daha detaylı bilgi için, adım adım bunu makineyi kurmak ve için protokolin yazılım, üreticinin web sitesini danışılmalıdır. Protein İçeriği Ölçme hücreleri bozmadan her bir kalan deney ortamını çıkarın. NOT: Bu protein konsantrasyonu deneyi devam etmek için uygun değildir, bu analize kadar -20 ° C 'de bütün plaka dondurmak mümkündür. donmuş, devam etmeden önce Çözülme. (50 ul için yeterli / oyuk) RIPA liziz ortamı içinde proteaz inhibitörleri 1 x çözeltisi (100X'lik bir stok) hazırlayın. her bir proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 50 ul RIPA liziz ortamı ekleyin. 5 dakika süre ile bir çalkalama plakası ajitasyon ve daha sonra tam olarak lize hücrelere 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe levhasını. bunlar bisinkoninik asit (BCA) deneyi karışmaz şekilde plakanın alt lipidler ve diğer moleküller getirmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de plaka dönerler. üreticiye göre BCA protein konsantrasyonu ölçmek &# 39; ın önerileri.