Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem LIG-4 Tier-Protokoll durchgeführt, das von der NIAID Animal Care und Use Committee genehmigt wurde. 1. Vorbereitung der Reagenzien Bereiten magnetische Trennung (MS) Puffer: PBS (pH 7,2), ergänzt mit 0,5% BSA und 2 mM EDTA oder automatische Trennlösung mit 0,5% BSA ergänzt war. Sterilfilter (0,22 & mgr; m) und bei 2-8 ° C. Bereiten RF10 Medium: RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 50 U / ml Penicillin, 50 uM Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 50 & mgr; M 2 beta; -Mercaptoethanol, 10 mM HEPES. Verwenden Sie sterile Reagenzien. Sterilfilter und bei 2-8 ° C. Bereiten Sie mitochondrialen Stresstest Medium: XF Basismedium mit 1 mM Natriumpyruvat ergänzt, 2 mM L-Glutamin und 25 mM Glucose. Bereiten Sie Glykolyse Stresstest Medium: XF Basismedium supplemented mit 2 mM L-Glutamin. Der pH-Wert sowohl der mitochondrialen und Glykolyse Stresstest Medien bis 7,4, Sterilfilter und bei 2-8 ° C. Warme Medium auf 37 ° C und erneut der pH-Wert vor der Verwendung (Durchführung pH-Messungen bei 37 ° C). HINWEIS: Die Verwendung XF Medium, das Bikarbonat fehlt, ist kritisch. Da die Atmosphäre in der extrazellulären Flux Analyzer nur Umgebungs CO 2 enthält, jede Bicarbonat in dem Medium, bei der Bindung an Protonen als Nebenprodukt der Glykolyse freigesetzt wird distanziere CO 2 und Wasser zu bilden. CO 2 wird entgasen während des Experiments, was Drifts in pH, die die glykolytischen Ansäuerung Signal verschleiern würden. Bereiten Sie Oligomycin: Bereiten 10 mM Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C. Bereiten 2,4-DNP: Bereiten Sie 1 M Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C. Bereiten Sie Antimycin A: Bereiten 10 mM Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C. Bereiten Sie Rotenon: Bereiten Sie 10 mM stock Lösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C. Bereiten Glucose: Man löst Glucose in Glykolyse Belastungstestmedium mit einer 250 mM Lösung zu bilden; Vorbereitung frisch vor jedem Experiment und nicht einfrieren. Bereiten Sie 2-DG: Man löst feste 2-DG in der Glykolyse Stresstest Medium mit einer 500 mM Lösung zu bilden; Vorbereitung frisch vor jedem Experiment und nicht einfrieren. 2. Ernte Milz und Lymphknoten von Mäusen Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Für die anschließende Zellisolierung T, ernten die Milz, oberflächliche Hals-, oberflächlichen / tiefen axillären, Kiefer, Leisten- und mesenterialen Lymphknoten. Für die anschließende B-Zell-Isolierung, Ernte nur die Milz. HINWEIS: ein Bio-Sicherheitsschrank verwenden und die entnommenen Organe in PBS oder RF10 Medien auf Eis, bis die Verarbeitung halten. Verwenden Sie sterile Laborgeräte und sterile Technik für die gesamte Verarbeitung und isolation Schritte. Halten Sie alle Puffer und Medien auf Eis Isolationseffizienz zu erhöhen und den Zelltod zu reduzieren. 3. Gewebeverarbeitung Legen Sie eine 70 um Zelle Sieb über eine 50 ml konischen Röhrchen und übertragen die Organe auf das Sieb. Für T-Zell-Isolierung, vereinen alle Organe und für B-Zell-Isolierung Übertragung nur die Milz. Mit dem Kolben aus einer sterilen 3 ml Spritze, Maische, das Gewebe durch das Sieb. Beim Maischen stellen Sie sicher, dass der Filter und die Organe zu jeder Zeit feucht sind und nass sie durch Zugabe von MS-Puffer erforderlich, da. Dies wird sowohl die Lebensfähigkeit der Zellen hoch zu halten und ein Verstopfen des Filters zu verhindern. Nach dem Maischen gelten 5-10 ml MS zu dem Filter Puffer Zellgewinnung zu erhöhen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. (Führen Sie alle weiteren Zentrifugationen unter diesen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben). Dekantiert die Flüssigkeit und das Pellet in 5 ml ACK roten Blutkörperchen Lysepuffer. IncuBeize für 5 min auf Eis roten Blutkörperchen (Erythrozyten müssen entfernt werden, weil sie mit der magnetischen Trennung stören) zu lysieren. In 10 bis 20 ml MS-Puffer und Zentrifuge. Legen Sie eine 30 um Zellenfilter über einen 15 ml konischen Röhrchen und ihn zunächst mit 1 ml MS-Puffer (diese Filtration wird Schmutz von der Erythrozytenlysepuffer entfernen). Die Flüssigkeit aus dem zentrifugierten Röhrchen, das Pellet in 5 ml MS-Puffer und es durch den Filter passieren. Waschen Sie die Anfangs Röhrchen mit 4 ml MS-Puffer Zellgewinnung zu erhöhen, und verwenden Sie diese um den Filter zu spülen. Verwendung eines Hämozytometers oder eines automatisierten Zellzähler, bestimmen die Gesamtzahl der Zellen. Diese Zellzahl wird verwendet, um die Menge der magnetischen Trennung Reagenzien in Abschnitt erforderlich, um zu bestimmen 4. Wenn Splenozyten sind in der nachfolgenden extrazellulären Flux-Test verwendet werden, die entsprechende Anzahl von Zellen zu diesem Zeitpunkt aufgehoben. Zentrifugieren Sie die Suspension und fahren Sie magnetische Trennung. Resuspendieren Splenozyten nicht verwendetfür B-Zell-Isolierung in 5 ml RF10 und auf Eis halten, bis der extrazellulären Fluss-Test. 4. Magnetische Trennung von B – Zellen und naiven CD4 + T – Zellen Bestimmen Sie die erforderlichen Mengen an Biotin-Antikörper-Cocktail, Anti-Biotin-Mikrokugeln und MS-Puffer. Verwenden Sie die folgenden Mengen für 10 8 Zellen als Leitfaden und vergrößern oder verkleinern, falls erforderlich. HINWEIS: Inkubieren Proben in einem Kühlschrank nicht auf Eis, da Eis auf Inkubation können Antikörper-Bindungseffizienz und längere Inkubationszeiten erforderlich sein könnten reduzieren. Reagenzien für naive CD4 + T – Zell – Trennungs Volume 10 8 Zellen (Skalierung entsprechend) Biotin-Antikörper-Cocktail 100 ul MS-Puffer für die erste Inkubation 400 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln 200 ul CD44 Microbeads 100 ul MS-Puffer für die zweite Inkubation 200 ul Inkubieren des Biotin-Antikörper-Cocktail und die Zellen bei 4 ° C für 5 min. Hinzufügen anti-Biotin-Microbeads, CD44 Microbeads, MS-Puffer und Inkubation bei 4 ° C für 15 min. Tabelle 1: T – Zell – Isolation Volumen und Anweisungen. Reagenzien für die B – Zell – Trennung Volume 10 8 Zellen (Skalierung entsprechend) Biotin-Antikörper-Cocktail </td> 100 ul MS-Puffer für die erste Inkubation 400 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln 200 ul MS-Puffer für die zweite Inkubation 300 ul Inkubieren des Biotin-Antikörper-Cocktail und die Zellen bei 4 ° C für 15 min. Fügen Sie die entsprechenden Volumen von Biotin-Antikörper-Cocktail und MS-Puffer, und Inkubieren der Mischung bei 4 ° C für 15 min. Fügen Sie die entsprechenden Volumen von anti-Biotin-Mikrobeads und MS-Puffer und die Mischung bei 4 ° C für 15 min inkubieren. Nach der zweiten Inkubation die Röhrchen mit MS-Puffer und Zentrifuge füllen. Tabelle 2: B – Zell – Isolation Volumen und Anweisungen. Das Pellet in MS-Puffer: 500 & mgr; l für die manuelle Trennung, 3-4 ml für die automatische Trennung. Fahren Sie mit entweder manuell oder automatisiert Trennungenwie folgt: Manuelle Trennung: Legen Sie eine LS-Säule in den Trennmagneten, legen Sie einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen unter den Durchfluss durch und prime die Säule durch Waschen mit 3 ml MS-Puffer zu sammeln. Entsorgen Sie die Strömung durch. Übertragen Sie die Zellsuspension auf die grundierte LS Säule gegeben und es durchlaufen; Waschen Sie die Röhrchen während der Inkubation mit 3 ml MS-Puffer und übergeben diese durch die Säule zum Einsatz. Das Eluat wird die gereinigten Zellen enthalten. Für B-Zell-Isolierung, passieren die gereinigten Zellen durch die Säule ein zweites Mal in eine neue 15-ml-Röhrchen, und wiederholen Sie den Waschschritt. Dies wird Reinheit und die Ausbeute zu erhöhen. Automatische Trennung: Schalten Sie den automatischen Separator und überprüfen Sie die Ebenen der Laufpuffer, Spüllösung und 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass der Abfall vor dem Start der Trennung ist leer. Wählen Sie die entsprechende gekühlt Rack je nach Rohrgröße von ter ungereinigte Probe (zB 15 ml). Um die Zellen lebensfähig während des Trennungsprozesses zu halten, verwenden Sie Racks, die 2-8 ° C für 3-4 Stunden bei zuvor gekühlt worden sind, oder bis das Kühlmittel wird fest. Montieren Sie die gekühlte Racks auf dem Probentisch des automatischen Separator. Platzieren Sie die Probenröhrchen in Steckplatz A1, ein Rohr für die negative Fraktion in Steckplatz B1 und ein Rohr für die positive Fraktion in C1. Wenn mehr als eine Probe zu sammeln, setzen zusätzliche Rohre in den nächsten Spalten (A2, B2, C2, etc.). Wählen Sie die Registerkarte Trennung auf dem Touchscreen, und zeigen die Anordnung von Rohren auf dem Rack. Von der Trennung Wählen Sie im Menü "Verbraucht" Programm und die Programmzyklus mit der entsprechenden Art von Wäsche vervollständigen (siehe Hinweis unten). HINWEIS: Die "Verbraucht" Programm führt Erschöpfung der Maschine am empfindlichsten Modus, was Reinheit priorisiert. Darüber hinaus gibt es drei verschiedene Waschmöglichkeiten: quick spülen, spülen, und schlafen. Wenn die Proben aus der gleichen Quelle sind und miteinander kombiniert werden sollen, wählen Sie schnelles Spülen. Wenn die Proben werden getrennt gehalten sind, wählen Sie spülen. Wählen Sie den Schlaf-Option, wenn keine weiteren Isolationen an diesem Tag durchgeführt und wird, wenn die Maschine wird abgeschaltet Isolation folgende Starten Sie die Isolation von "Run" drücken und bestätigen Sie die Pufferstufen, wenn Sie dazu aufgefordert. Nachdem das Programm beendet ist, wird die negative Fraktion gereinigter Zellen enthalten. Füllen Sie das konische Röhrchen bis zu 15 ml mit MS-Puffer und Zentrifuge. Dekantiert die MS-Puffer und resuspendieren Zellen in 5 ml RF10 Medien. Halten Sie Zellen auf Eis, bis der extrazellulären Fluss-Test. HINWEIS: Im Idealfall, den extrazellulären Fluss Test sollte sofort nach der Isolierung durchgeführt werden. in Vorversuchen jedoch keine signifikanten Unterschiede in Assay-Ergebnisse wurden in Zellen beobachtet wurde innerhalb von 3 h der Isolation gegenüber frisch isoliert diejenigen verwendet. <p class = "jove_title"> 5. Extracellular Flux Assay HINWEIS: Das Protokoll ist hier skizzierte für das 96-Well-Format des Instruments. Volumes müssen angepasst werden, wenn ein anderes Format verwendet wird. Hydratisierung von Sensorkartusche Heben Sie die Sensorkassette nach oben, füllen jede Vertiefung der Utility-Platte mit 200 ul Kalibrierlösung und senken Sie die Sensorkartusche auf die Utility-Platte, Eintauchen der Sensoren in der Kalibrierlösung. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierlösung hoch genug ist, um die Sensoren unter Wasser zu halten. Die Patrone beherbergt Fluorophore zu O 2 zugeordnet ist und H + für jede Vertiefung; diese müssen mit Feuchtigkeit versorgt werden, um für sie richtig zu arbeiten. Legen Sie die Patrone in einem 37 ° C Inkubator nicht mit CO 2 ergänzt oder Sauerstoff / Stickstoff. Führen Sie alle weiteren Inkubationen unter diesen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben. Inkubieren Sie die Patrone über Nacht Hydrat. preparation von klebstoffbeschichteten Platten Bereiten 2,5 ml einer 22,4 & mgr; g / ml Klebstofflösung in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0 (Bicarbonat liefert den optimalen pH-Wert für die Klebstoff-Adsorption). Anwenden 25 ul der Lösung zu jeder Vertiefung der Testplatte, und Inkubieren auf der Bank bei Raumtemperatur für 20 min. Absaugen Klebstoff und waschen Sie jedes Well zweimal mit 200 & mgr; l sterilem Wasser. Warten Sie, bis Brunnen trocken sind, bevor die Zellen Aussaat. Seeding Zellen in klebstoffbeschichteten Platten Zentrifugen Zellen bei Raumtemperatur bei 200 × g für 5 min. Die Zellen in 5 ml des entsprechenden Testmedium (siehe oben für die Formulierung der mitochondrialen Belastung und Glukose Stress Medien). Zentrifugen Zellen wieder und resuspendieren in der gewünschten Konzentration in Testmedium (Resuspensionsvolumen auf Konzentration variieren; jede Vertiefung enthält 180 & mgr; l der Zellsuspension). HINWEIS: Solange die entsprechenden Testmedien und Verbindungs verwendet werden, die extrazelluläre Fluss Analysator gleichzeitig die mitochondriale und Glykolyse Stresstests auf der gleichen Platte ausgeführt werden kann. Platte 180 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung geben. Verwenden Brunnen A1, A12, H1 und H12 für die Hintergrundtemperaturkorrektur: in 180 & mgr; l Assay-Medium in diesen Brunnen (keine Zellen). Inkubieren Platten für 25 min bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 5 min ohne Bremse, um sicherzustellen, dass alle Zellen vollständig angeschlossen haben. Optisch bestätigen, dass die Zellen, die stabil auf der Kulturoberfläche anhaften, um eine Monoschicht bilden, durch unter dem Mikroskop betrachtet. Übertragen Sie die Platten zurück in den Inkubator für weitere 30 min. Herstellung von 10-fach Konzentrationen von Verbindungen, und Laden von Injector Ports Für die mitochondrialen Stresstest vorbereiten jeweils 2,5 ml von 10 & mgr; M Oligomycin, 1 mM DNP und einer Mischung aus 10 & mgr; M Rotenon und 10 & mgr; M Antimycin A, die alle in der mitochondrialen Stress-Test mediuMeter HINWEIS: Die Konzentration von 2,4-DNP basiert auf zuvor veröffentlichten Studien; 21 Dieses ist eine allgemeine Richtlinie , aber die Konzentration der Entkoppler für jede Zelle verwendet werden , sollten vom Forscher bestimmt werden. Für die Glykolyse Stresstest vorbereiten jeweils 2,5 ml von 250 mM Glucose, 10 & mgr; M Oligomycin und 500 mM 2-Desoxyglucose (2-DG) in der Glykolyse Stresstestmedium. Warm 10x Lösungen auf 37 ° C und pH-Einstellung auf 7,4. Legen Sie die Verbindungen in die entsprechenden Injektors Ports der Patrone einer mehrkanaligen Mikropipetter und die Ladeführungen wie folgt mit: Hafen Mitochondriale Stress – Test Glykolyse Stress – Test EIN 20 ul Oligomycin 20 & mgr; l Glucose B 22 & mgr; l 2,4-DNP 22 & mgr; l Oligomycin C 25 ul Antimycin A / Rotenon 25 & mgr; l 2-DG Tabelle 3: Verbindung Bände. HINWEIS: Jede Reihe von Ports (zB alle Ports A) müssen das gleiche Volumen enthalten. Es ist wichtig, dass alle Vertiefungen in einer gegebenen Reihe geladen werden, auch wenn diese nicht in dem Experiment verwendet, da sonst die Verbindungen nicht injiziert werden (Ports in ungenutzten Vertiefungen können mit dem gleichen Volumen an Assaymedium geladen werden). Inkubieren Sie die Patrone, während das Programm einrichten. Einrichten extrazellulärer Flux Assay-Protokolle Stellen Sie das folgende Programm auf (Tabelle 4). Schritt Schleife </tr> Kalibrierung – Equilibrierung – Baseline-Lesungen 3 mal: Mix 3 min, warten 0 min, messen 3 min End-Schleife – Injizieren Port A – Messungen 3 mal: Mix 3 min, warten 0 min, messen 3 min End-Schleife – Injizieren Anschluss B – Messungen 3 mal: Mix 3 min, warten 0 min, messen 3 min End-Schleife – Injizieren Anschluss C – Messungen 3 mal: Mix 3 min, warten 0 min, measure 3 min End-Schleife – Programm beenden – Tabelle 4: Programm – Layout. HINWEIS: Unter bestimmten Bedingungen, zB bei der aktivierten Zellen verwendet, kann die Versauerung für mehr weiter als in naiven Zellen. Aus diesem Grund kann es notwendig sein, die "wait" -Zeiten in dem obigen Programm zu verlängern oder jeder Zyklus Messung mehrmals wiederholen. Beginnen Sie mit dem Programm. Nach dem Kalibrierungsschritt, ersetzen Sie die Kalibrant Platte für die Assayplatte (bei Aufforderung). HINWEIS: Mit der Software ist es möglich, Gruppen von Brunnen, um anzuzeigen, die ähnliche Bedingungen haben. Zusätzlich ist es entscheidend, die Vertiefungen sind die Kontrollvertiefungen geben (in diesem Protokoll sind sie die vier Ecken der Platte) und um anzuzeigen, welche Vertiefungen leer sind. Für eine detaillierte Schritt-für-Schritt, Protokoll zum Einrichten der Maschine und ess-Software, sollte die Website des Herstellers zu Rate gezogen werden. Messproteingehalt Entfernen Sie den verbleibenden Testmedium aus jeder Vertiefung, ohne die Zellen zu stören. HINWEIS: Wenn es nicht praktisch ist mit der Proteinkonzentration Test ablaufen, ist es möglich, die gesamte Platte bei -20 ° C bis zur Analyse einzufrieren. Wenn gefroren, aufgetaut, bevor Sie fortfahren. Bereiten Sie eine 1x-Lösung von Protease-Inhibitoren (100x Lager) in RIPA Lysemedium (ausreichend für 50 & mgr; l / Well). In 50 ul RIPA Lysemedium mit Protease-Inhibitoren ergänzt jede Vertiefung. Rühre Platte auf einem Schüttler für 5 Minuten, und dann Platte für 30 Minuten vollständig zu lysieren Zellen auf Eis inkubiert. Drehen die Platte bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur Lipiden und anderen Molekülen an die Unterseite der Platte zu bringen, so dass sie nicht mit dem Bicinchoninsäure (BCA) Assay stören. Messen Proteinkonzentration von BCA-Test nach Hersteller &# 39; s Empfehlungen.