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Immunology and Infection

Un protocole optimisé pour l'analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

Published: November 21, 2016
doi:
10.3791/54918
, , , ,
1Laboratory of Mitochondrial Biology and Metabolism, National Heart, Lung, and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health

Summary

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Abstract

Les lymphocytes répondent à une variété de stimuli en activant les voies de signalisation intracellulaire, ce qui à son tour conduit à une rapide prolifération cellulaire, la migration et la différenciation et la production de cytokines. Tous ces événements sont étroitement liés à l'état d'énergie de la cellule, et d'étudier ainsi les voies de production d'énergie peut donner des indices sur la fonctionnalité globale de ces cellules. L'analyseur de flux extracellulaire est un dispositif couramment utilisé pour évaluer la performance de la glycolyse et la respiration mitochondriale dans de nombreux types cellulaires. Ce système a été utilisé pour étudier les cellules immunitaires dans quelques rapports publiés, mais un protocole global optimisé en particulier pour les lymphocytes est manquant. Les lymphocytes sont des cellules fragiles qui survivent mal en conditions ex vivo. Souvent les sous-ensembles de lymphocytes sont rares, et de travailler avec un faible nombre de cellules est inévitable. Ainsi, une stratégie expérimentale qui traite de ces difficultés est nécessaire. Ici, nous fournissons un protocolequi permet l'isolement rapide des lymphocytes viables à partir des tissus lymphoïdes, ainsi que pour l'analyse de leurs états métaboliques dans l'analyseur de flux extracellulaire. En outre, nous fournissons des résultats d'expériences dans lesquelles on a comparé les activités métaboliques de plusieurs sous-types de lymphocytes à différentes densités cellulaires. Ces observations suggèrent que notre protocole peut être utilisé pour obtenir des résultats cohérents, bien standardisés, même à de faibles concentrations de cellules, et donc il peut avoir de vastes applications dans les futures études portant sur la caractérisation des événements métaboliques dans les cellules immunitaires.

Introduction

La réponse immunitaire contre des antigènes est un équilibre étroitement régulé entre l'activation immunitaire et la suppression immunitaire. Activation du système immunitaire entraîne une prolifération rapide et la migration cellulaires, ainsi que la production de cytokines, la sécrétion d' anticorps et une augmentation de la phagocytose en réponse à l' effet stimulant, tandis que la suppression immunitaire inhibe simplement ces événements et il est donc important dans la prévention des réponses immunitaires inutiles 1-6. Des études récentes ont montré qu'une liaison directe entre l'état d'activation des cellules immunitaires et de l'activité de diverses voies métaboliques 7. Les cellules immunitaires peuvent se déplacer entre repos et activés par les états de commutation d'énergie produisant des voies et hors tension. En outre, il a été observé que différents types de cellules immunitaires peuvent utiliser différentes stratégies métaboliques pour alimenter les besoins accrus en énergie pendant l'activation. Par exemple, tandis que l' activation des lymphocytes T dirige les cellules dans un état presque complètement glycolytique 8 </sup>, les lymphocytes B activés utiliser un équilibre de la glycolyse et la phosphorylation oxydative 9,10. Ces études soulignent l'importance d'étudier les effets de l'activation des cellules immunitaires sur le métabolisme cellulaire.

En temps réel, des mesures simultanées de taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR), comme indicateurs de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, est une stratégie commune pour faire face aux états d'énergie produisant des voies 11-13. Afin d'atteindre cet objectif, un analyseur de flux extracellulaire, tel que le 96 Hippocampe XF, est couramment utilisé. Un tel instrument peut rapidement comparer les changements dans l'OCR et ECAR pour tous les types de cellules ou sur différentes conditions de stimulation. Jusqu'à présent, divers types de cellules, y compris les cellules du système immunitaire, ont été étudiées à l'aide de ces dispositifs. Cependant, un protocole optimisé spécialement conçu pour les cellules immunitaires ne sont pas disponibles.

Les cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes, diffèrent d'otses types cellulaires de plusieurs façons critiques. Les lymphocytes sont des cellules fragiles qui ne survivent pas pendant de longues durées dans des conditions ex vivo 14-16. Ceci est encore plus question quand ils sont cultivés dans des milieux de croissance suboptimale manque de nutriments essentiels, tels que ceux utilisés dans l'analyse de flux extracellulaire. A la différence des macrophages et de nombreuses lignées cellulaires, les lymphocytes ne respectent pas les surfaces en plastique; il est donc essentiel de les attacher à la plaque d'analyse sans générer de stress. Enfin, certaines sous – populations lymphocytaires peuvent être extrêmement rares et les récolter au, des quantités optimales requises pourraient être difficiles 17-19.

Ici, nous fournissons un protocole optimisé qui est spécifiquement développé pour les lymphocytes. Utilisation de splénocytes, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 + naïfs isolés de la rate de la souris et les ganglions lymphatiques 20, nous montrons les caractéristiques de leur état de repos glycolyse et la phosphorylation oxydative à différent densités cellulaires. Les données ont été normalisées pour tenir compte des différences dans le nombre de cellules initiales pour chaque puits en mesurant le lysat cellulaire des concentrations de protéine de dosage d'extrémité, qui sont directement proportionnelles aux nombres de cellules. Notre protocole fournit non seulement des lignes directrices pour l'isolement rapide de lymphocytes viables pour les dosages de flux extracellulaire, mais il permet aussi de travailler à des concentrations cellulaires suboptimales sans compromettre la qualité des données.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec le protocole animal LIG-4, qui a été approuvé par le Comité soin et l'utilisation des animaux NIAID. 1. Préparation des réactifs Préparer un tampon de séparation magnétique (MS): PBS (pH 7,2) supplémentée avec 0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA ou d'une solution de séparation automatique supplémenté avec 0,5% de BSA. Filtre stérile (0,22 um) et stocker à 2-8 ° C. Préparer milieu RF10: milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur, 50 U / ml de pénicilline, 50 uM de streptomycine, du pyruvate de sodium 1 mM, 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 50 uM 2 mercaptoéthanol, 10 mM de HEPES. Utiliser des réactifs stériles. Filtre stérile et stocker à 2-8 ° C. Préparer mitochondrial milieu de test de stress: milieu de base XF complété avec du pyruvate de sodium à 1 mM, 2 mM de L-glutamine et 25 mM de glucose. Préparer le milieu de test de stress de la glycolyse: moyennes supplémen de base XFted avec 2 mM de L-glutamine. Ajuster le pH à la fois les milieux d'essai mitochondrial et le stress de la glycolyse à 7,4, filtre stérile et stocker à 2-8 ° C. médias chauds à 37 ° C et ré-ajuster le pH avant utilisation (effectuer des mesures de pH à 37 ° C). REMARQUE: L'utilisation moyenne XF, qui manque de bicarbonate, est critique. Comme l'atmosphère dans l'analyseur de flux extracellulaire ne contient que du CO 2 ambiante, tout bicarbonate dans le milieu, lors de la liaison à protons libérés comme sous – produit de la glycolyse, va se dissocier pour former du CO 2 et de l' eau. CO 2 sera dégazer pendant l'expérience, ce qui provoque des dérives de pH qui obscurcir le signal d'acidification de la glycolyse. Préparer oligomycine: Préparer 10 mM solution mère dans du DMSO; stocker à -20 ° C. Préparer 2,4-DNP: Préparer 1 M solution mère dans du DMSO; stocker à -20 ° C. Préparer antimycine A: Préparer 10 mM solution mère dans du DMSO; stocker à -20 ° C. Préparer roténone: Préparer 10 mM ssolution de tock dans le DMSO; stocker à -20 ° C. Préparer le glucose: Dissoudre le glucose dans le milieu de test de stress de la glycolyse pour former une solution de 250 mM; préparer fraîche avant chaque expérience et ne pas congeler. Préparer 2-DG: Dissoudre solide 2-DG dans le milieu de test de stress de la glycolyse pour former une solution à 500 mM; préparer fraîche avant chaque expérience et ne pas congeler. 2. La récolte Spleen et les ganglions lymphatiques de la souris Euthanize la souris par asphyxie au CO2 suivie d' une dislocation cervicale. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. Pour l'isolement ultérieur des cellules T, la récolte de la rate, cervical superficiel, superficiel axillaire / profond, mandibulaire, inguinale, et les ganglions lymphatiques mésentériques. Pour l'isolement des cellules B subséquente, la récolte ne la rate. REMARQUE: Utiliser une enceinte de biosécurité et de garder les organes prélevés dans du PBS ou médias RF10 sur la glace jusqu'à la transformation. Utilisez labware stérile et technique stérile pour tous les traitements et isolétapes ation. Gardez tous les tampons et les médias sur la glace pour augmenter l'efficacité de l'isolement et de réduire la mort cellulaire. 3. Traitement des tissus Placer une passoire 70 um de la cellule sur un tube conique de 50 ml et transférer les organes sur la crépine. Pour l'isolement des cellules T, combiner tous les organes et B transfert d'isolement cellulaire seulement la rate. Utilisation du piston d'une seringue de 3 ml stériles, écrasez le tissu à travers le tamis. Pendant le brassage, assurez-vous que le filtre et les organes sont humides en tout temps et les mouiller au besoin en ajoutant un tampon MS. Cela permettra à la fois maintenir la viabilité cellulaire élevée et éviter le colmatage du filtre. Après brassage, appliquer 5-10 ml MS tampon au filtre pour augmenter la récupération des cellules. Centrifuger la suspension à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. (Effectuer toutes autres centrifugations dans ces conditions, sauf indication contraire). Décanter le liquide et remettre en suspension le culot dans un tampon de lyse des globules rouges du sang de 5 ml ACK. Incubate pendant 5 min sur de la glace pour lyser les globules rouges (les globules rouges doivent être éliminés car ils interfèrent avec la séparation magnétique). Ajouter 10-20 ml tampon MS et centrifuger. Placer un filtre cellulaire de 30 pm sur un tube de 15 ml conique et l'amorcer avec 1 ml de tampon MS (cette filtration va enlever les débris de la lyse des érythrocytes). Décanter le liquide du tube centrifugé, resuspendre le culot dans 5 ml MS tampon et le passer à travers le filtre. Laver le tube initial avec 4 ml MS tampon pour augmenter la récupération des cellules, et l'utiliser pour rincer le filtre. En utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé, déterminer le nombre total de cellules. Ce numéro de cellule sera utilisée pour déterminer la quantité de réactifs de séparation magnétique nécessaires à la section 4. Si splénocytes doivent être utilisés dans le dosage de flux extracellulaire ultérieure, mis de côté le nombre approprié de cellules à ce moment. Centrifuger la suspension et procéder à une séparation magnétique. Remettre en suspension les splénocytes non utilisésB isolement cellulaire dans 5 ml RF10 et garder sur la glace jusqu'à ce que le test de flux extracellulaire. 4. Séparation magnétique des cellules B et Naïf cellules T CD4 + Déterminer les volumes nécessaires de cocktail biotine-anticorps, les microbilles anti-biotine, et le tampon MS. Utilisez les volumes suivants pour 10 8 cellules comme un guide et l' échelle vers le haut ou vers le bas si nécessaire. NOTE: Incuber les échantillons dans un réfrigérateur plutôt que sur la glace depuis l'incubation sur la glace peut réduire l'efficacité de liaison d'anticorps et de plus longues durées d'incubation peuvent être nécessaires. Réactifs pour la séparation naïve des cellules CD4 + T Volume 10 8 cellules (échelle appropriée) Biotine-anticorps cocktail 100 ul tampon MS pour la première incubation 400 ul microbilles anti-biotine 200 ul les microbilles CD44 100 ul tampon MS pour la deuxième incubation 200 ul Incuber les cellules et le cocktail biotine-anticorps à 4 ° C pendant 5 min. Ajouter microbilles anti-biotine, microbilles CD44, tampon MS et incuber à 4 ° C pendant 15 min. Tableau 1: Volume d'isolement des cellules T et des instructions. Des réactifs pour la séparation des lymphocytes B Volume 10 8 cellules (échelle appropriée) Biotine-anticorps cocktail </td> 100 ul tampon MS pour la première incubation 400 ul microbilles anti-biotine 200 ul tampon MS pour la deuxième incubation 300 ul Incuber les cellules et le cocktail biotine-anticorps à 4 ° C pendant 15 min. Ajouter le volume approprié de biotine-anticorps cocktail et un tampon MS, et incuber le mélange à 4 ° C pendant 15 min. Ajouter le volume approprié de microbilles anti-biotine et le tampon MS et incuber le mélange à 4 ° C pendant 15 min. Après la seconde incubation, remplir le tube avec un tampon MS et centrifuger. Tableau 2: Volume d'isolement des cellules B et des instructions. Reprendre le culot dans un tampon MS: 500 pi pour la séparation manuelle, 3-4 ml pour la séparation automatique. Continuer avec soit des séparations manuelles ou automatiséescomme suit: Séparation manuelle: Insérez une colonne LS dans l'aimant de séparation, placer un tube conique stérile de 15 ml ci-dessous pour recueillir l'écoulement à travers, et amorcer la colonne par lavage avec 3 ml de tampon MS. Jeter l'écoulement à travers. Transférer la suspension cellulaire à la colonne LS apprêté et lui permettre de passer à travers; laver le tube utilisé pendant l'incubation avec 3 ml de tampon MS et passent ce à travers la colonne ainsi. L'éluat contient les cellules purifiées. Pour l'isolement des cellules B, passer les cellules purifiées à travers la colonne une deuxième fois dans un nouveau tube de 15 ml, et répéter l'étape de lavage. Cela permettra d'accroître la pureté et le rendement. Séparation automatique: Allumez le séparateur automatique et vérifier les niveaux de tampon en cours d'exécution, la solution et 70% d'éthanol de rinçage. Veiller à ce que les déchets est vide avant de commencer la séparation. Sélectionner la grille refroidie appropriée en fonction de la taille du tube de til échantillon non purifié (par exemple, 15 ml). Afin de maintenir les cellules viables tout au long du processus de séparation, utiliser des supports qui ont été préalablement refroidis à 2-8 ° C pendant 3-4 heures, ou jusqu'à ce que le liquide de refroidissement devient solide. Monter la grille refroidie sur la scène du séparateur automatique des échantillons. Placer le tube d'échantillon dans la fente A1, un tube destiné à la fraction négative dans la fente B1, et un tube destiné à la fraction positive C1. Si la collecte de plus d'un échantillon, placer des tubes supplémentaires dans les colonnes suivantes (A2, B2, C2, etc.). Sélectionnez l'onglet de séparation sur l'écran tactile, et indiquer la disposition des tubes sur le rack. Dans le menu de séparation, sélectionnez le programme «épuise» et compléter le cycle de programme avec le type approprié de lavage (voir note ci-dessous). NOTE: Le programme "épuise" réalise l'épuisement en utilisant le mode le plus sensible de la machine, qui privilégie la pureté. En outre, il y a trois options de lavage différentes: quick rincer, rincer, et le sommeil. Si les échantillons proviennent de la même source et doivent être combinés, sélectionnez rinçage rapide. Si les échantillons doivent être conservés séparément, sélectionnez rinçage. Sélectionnez l'option de sommeil si aucune autre isolements seront effectués ce jour-là et si la machine sera arrêtée suite à l'isolement Démarrez l'isolement en appuyant sur "Exécuter" et confirmer les niveaux de mémoire tampon lorsque vous êtes invité. Après la fin du programme, la fraction négative contiendra des cellules purifiées. Remplir le tube conique jusqu'à 15 ml avec du tampon SP et centrifugation. Décanter tampon MS et remettre les cellules dans 5 ml de milieu de RF10. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à ce que le test de flux extracellulaire. NOTE: Idéalement, le dosage du flux extracellulaire doit être effectuée immédiatement après l'isolement. Cependant, dans des expériences préliminaires, aucune différence significative dans les résultats analytiques ont été observés dans les cellules utilisées à moins de 3 h d'isolement par rapport à ceux fraîchement isolés. <p class = "jove_title"> 5. Extracellulaires Flux Assay NOTE: Le protocole décrit ici est pour le format 96 puits de l'instrument. Les volumes devront être ajustées si un autre format est utilisé. Hydratation Sensor Cartridge Soulevez la cartouche du capteur, remplir chaque puits de la plaque d'utilité avec 200 pi de solution d'étalonnage et d'abaisser la cartouche du capteur sur la plaque d'utilité, submergeant les capteurs dans la solution d'étalonnage. REMARQUE: Vérifiez que le niveau de la solution d'étalonnage est suffisamment élevée pour maintenir les capteurs immergés. La cartouche ports fluorophores associés à l' O 2 et H + pour chaque puits; ceux-ci doivent être hydratée afin qu'ils fonctionnent correctement. Placer la cartouche dans un incubateur à 37 ° non complémenté avec du CO 2 ou de l' oxygène / azote. Effectuer toutes autres incubations dans ces conditions, sauf indication contraire. Incuber la cartouche pendant la nuit pour hydrater. Preparation des plaques encollées Préparer 2,5 ml d'une / ml de solution d'adhésif de 22,4 pg dans 0,1 M de bicarbonate de sodium, pH 8,0 (bicarbonate fournit le pH optimal pour l'adhésif adsorption). Appliquer 25 ul de la solution à chaque puits de la plaque d'essai et laisser incuber sur le banc à température ambiante pendant 20 min. Aspirer adhésif et laver chaque puits deux fois en utilisant 200 pi d'eau stérile. Attendez jusqu'à ce que les puits sont secs avant l'ensemencement des cellules. Ensemencement des cellules en plaques encollées Centrifuger les cellules à la température ambiante à 200 xg pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu d'essai approprié (voir ci-dessus pour la formulation de stress mitochondrial et milieux de stress glucose). Centrifuger les cellules à nouveau et remettre en suspension à la concentration désirée dans un milieu d'essai (volume de resuspension varient en fonction de la concentration, chacun va bien contenir 180 ul de suspension cellulaire). REMARQUE: Tant que les médias et composé d'analyse appropriéss sont utilisés, l'analyseur de flux extracellulaire peut exécuter simultanément les mitochondries et le stress de la glycolyse des tests sur la même plaque. Plaque 180 pl de suspension cellulaire dans chaque puits. Utiliser les puits A1, A12, H1, H12 et pour la correction de la température de fond: ajouter 180 ul de milieu d'essai dans ces puits (pas de cellules). Incuber les plaques pendant 25 minutes à 37 ° C. Centrifuger la plaque à 200 g pendant 5 min sans frein pour faire en sorte que toutes les cellules soient complètement ci-joint. Confirmer visuellement que les cellules sont de manière stable ont adhéré à la surface de culture, la formation d'une monocouche, en observant au microscope. Transférer les plaques vers l'incubateur pendant 30 minutes supplémentaires. Préparation de 10x Les concentrations de composés, et chargement des ports Injector Pour le test de stress mitochondrial, préparer 2,5 ml chacune de 10 uM oligomycine, 1 mM DNP, et un mélange de 10 uM roténone et 10 uM antimycine A, tous dans mitochondrial test de stress medium. NOTE: La concentration de 2,4-DNP est basée sur des études précédemment publiées; 21 ceci est une ligne directrice générale , mais la concentration de découpleur pour chaque type de cellule utilisée doit être déterminée par le chercheur. Pour le test de stress de la glycolyse, préparer 2,5 ml chacune de 250 mM de glucose, 10 uM oligomycine, et 500 mM de 2-désoxyglucose (2-DG) dans un milieu glycolyse d'essai de stress. Chaud 10x solutions à 37 ° C, et ajuster le pH à 7,4. Charger les composés dans les orifices d'injection appropriés de la cartouche à l'aide d'une micropipette multi-canaux et les guides de chargement, comme suit: Port Mitochondrial Stress Test Glycolyse Stress Test UNE 20 ul oligomycine 20 glucose ul B 22 ul de 2,4-DNP 22 ul oligomycine C 25 ul antimycine A / roténone 25 pi de 2-DG Tableau 3: volumes composés. NOTE: Chaque série de ports (par exemple, tous les ports A) doivent contenir le même volume. Il est essentiel que tous les puits d'une même série sont chargés, même ceux qui ne sont pas utilisés dans l'expérience, par ailleurs, les composés ne sont pas injectés (ports dans les puits non utilisés peuvent être chargés avec le même volume de milieu de dosage). Incuber la cartouche lors de la configuration du programme. Configuration extracellulaires Flux Assay Protocoles Mettre en place le programme suivant (tableau 4). Étape Boucle </tr> Étalonnage – équilibration – lectures de base 3 fois: Mélanger 3 min, attendre 0 min, mesure 3 min Fin de boucle – Injecter Port A – Des mesures 3 fois: Mélanger 3 min, attendre 0 min, mesure 3 min Fin de boucle – Injecter Port B – Des mesures 3 fois: Mélanger 3 min, attendre 0 min, mesure 3 min Fin de boucle – Injecter Port C – Des mesures 3 fois: Mélanger 3 min, attendre 0 min, mesure 3 min Fin de boucle – Programme de fin – Tableau 4: mise en page du programme. NOTE: Dans certaines conditions, par exemple, lors de l' utilisation des cellules activées, l'acidification peut se poursuivre pendant plus longtemps que dans les cellules naïves. Pour cette raison, il peut être nécessaire d'étendre les «attendre» fois dans le programme ci-dessus ou de répéter chaque cycle de mesure plusieurs fois. Commencez le programme. Après l'étape de calibration, remplacer la plaque calibrant pour la plaque test (lorsque vous êtes invité). REMARQUE: L'utilisation du logiciel, il est possible d'indiquer des groupes de puits qui ont des conditions similaires. En outre, il est essentiel d'indiquer quels puits sont des puits de contrôle (dans ce protocole, ils sont les quatre coins de la plaque) et d'indiquer quels puits sont vides. Pour une analyse plus détaillée, étape par étape, protocole pour la mise en place de la machine et ils le logiciel, le site Web du fabricant doit être consulté. Teneur en protéines de mesure Retirer le milieu d'essai restant dans chaque puits, sans perturber les cellules. Remarque: S'il est commode de procéder à l'analyse de la concentration en protéines, il est possible de figer l'ensemble de la plaque à -20 ° C jusqu'à l'analyse. En cas de gel, dégel avant de continuer. Préparer une solution 1x des inhibiteurs de la protéase (100x stock) dans un milieu de lyse RIPA (suffisant pour 50 pl / puits). Ajouter 50 ul de milieu de lyse RIPA additionné d'inhibiteurs de protéase à chaque puits. Agiter la plaque sur un agitateur pendant 5 min, puis laisser incuber la plaque sur la glace pendant 30 min à des cellules entièrement lysent. Faire tourner la plaque à 200 g pendant 5 min à température ambiante pour amener les lipides et d'autres molécules au fond de la plaque de manière à ne pas interférer avec le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA). Mesurer la concentration en protéine par dosage BCA selon le fabricant &les recommandations; # 39.

Representative Results

Les cellules eucaryotes utilisent un réseau intégré de glycolyse, l'acide tricarboxylique (TCA) cycle et la phosphorylation oxydative pour répondre à la majorité de leurs besoins en énergie et de fournir des produits intermédiaires nécessaires à la croissance et la prolifération cellulaire. Ces voies commencent par le piégeage intracellulaire de glucose libre dans la forme de glucose-6-phosphate, qui a ensuite obtient transformé en pyruvate. Pyruvate est soit réduit en lactate ou transportés dans les mitochondries, où elle forme acétyl-coenzyme A (CoA). Acétyl CoA pénètre ensuite dans le cycle de TCA. Des intermédiaires de haute énergie du cycle TCA propulsent le mouvement des électrons dans la chaîne de transport d'électrons (CTE), ce qui expulse les ions H + de la matrice mitochondriale pour générer un gradient H + à travers la membrane mitochondriale interne. L' oxygène agit comme accepteur final d'électrons, et H + retour de nouveau à la matrice mitochondriale à travers le F O / F <sub> 1 complexe, où son énergie potentielle est utilisée pour générer l' ATP (figure 1A). Le principe de fonctionnement de l'essai de flux extracellulaire dépend interférer avec la glycolyse et la phosphorylation oxydative à des points spécifiques, et d'évaluer les effets résultants. A cet effet, on a utilisé du glucose pour propager la glycolyse dans les cellules privées, et le 2-désoxyglucose (2-DG), qui est converti en 2-désoxyglucose-6-phosphate, un inhibiteur compétitif de la phosphoglucoisomérase 23, par l' hexokinase, afin de bloquer glycolyse. La roténone (un inhibiteur spécifique complexe-I du CTE), l' antimycine A (un complexe inhibiteur III spécifique du CTE), oligomycine (inhibiteur de l' ATP synthase 24), et l'agent de désaccouplement 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 étaient utilisé pour intervenir des événements spécifiques liés au transport des électrons, le gradient de protons et la synthèse d' ATP (figure 1A). Au lieu de 2,4-DNP, carbonyl cyanide-4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) peut aussi être utilisé, mais une optimisation supplémentaire peut être nécessaire. Dans les deux cas, découplants doivent toujours être titrés pour un type de cellule spécifique avant utilisation afin de déterminer la concentration optimale nécessaire. Le test de stress de la glycolyse (figure 1B) commence par une mesure de base du taux d'acidification extracellulaire (ECAR) dans les cellules précédemment affamés. Étant donné que ces cellules sont à leur minimum de base, et peuvent donc être considérés comme pratiquement non-glycolytique, l'ECAR mesurée à ce stade est appelé l'acidification non-glycolytique. Cette acidification correspond probablement au CO 2 respiratoire généré dans le cycle TCA étant converti en HCO 3 – et H +. Ceci est suivi par l'injection de glucose pour activer la glycolyse, qui présente comme une augmentation de l'acidification extracellulaire due à la formation de lactate.Cette augmentation représente le taux normal de la glycolyse. Les cellules sont ensuite provoqués avec l'injection de oligomycine, qui bloque la production d'ATP par la phosphorylation oxydative. Les cellules répondent à cette diminution spectaculaire de la production d'ATP en activant la glycolyse à son niveau maximum, et qui se traduit par une augmentation secondaire du niveau de ECAR (Réserve glycolyse). Le test se termine par une inhibition totale de la glycolyse en utilisant l'analogue du glucose 2-DG, qui renvoie l'ECAR à son niveau non-glycolytique. Fait intéressant, il a été proposé que, contrairement aux recommandations du fabricant, la glycolyse maximale est pas nécessairement obtenue par l'injection de 26 oligomycine. Dans les cellules avec une capacité glycolytique élevée, s'il n'y a pas une augmentation significative de la demande ATP, glycolyse peut être parfaitement en mesure de faire face à la perte de l'ATP mitochondrial sans avoir besoin d'être régulée à la hausse. Le taux glycolyse avec oligomycine pourrait être dépassé par l'ajout d'inhibiteurs respiratoires, Comme la roténone et myxothiazol, qui fournissent quelques avantages par rapport oligomycine: 1) Ils augmentent la demande ATP, car ils provoquent le renversement de l' ATP synthase, avec hydrolyse de l' ATP, pour pomper les protons dans une tentative de récupérer le potentiel de la membrane mitochondriale 26; 2) Ils empêchent l'acidification des voies respiratoires du milieu, qui peut confondre les résultats de ECAR (voir ci-dessous). D' autres façons d'augmenter la demande d' ATP comprennent l'ajout de composés qui stimulent l'hydrolyse de l' ATP par les ATPases de la membrane plasmique 26. Tout cela doit être soigneusement examinée par les chercheurs lors de la planification d'un test de stress de la glycolyse. Le test de stress mitochondrial (figure 1C) commence par une mesure de base du taux de consommation d'oxygène (OCR) dans des cellules non-faim. Ceci est suivi par l'injection d'oligomycine, ce qui empêche le retour de protons par l'intermédiaire du complexe F O / F 1 et donc rapidement hyperpolarizes de la membrane mitochondriale. Hyperpolarisation empêche la poursuite de protons de pompage à travers les complexes respiratoires, et les baisses de taux respiratoires. La respiration restante est appelée fuite de protons, ce qui représente le flux de protons à travers des lipides ou d'autres canaux. Cet état hyperpolarisé est rapidement inversée par l'addition de l'agent de désaccouplement 2,4-DNP, qui agit comme un ionophore protonique. En réponse, les cellules tentent de récupérer le potentiel de membrane dans une vaine tentative en augmentant le taux de transport d'électrons à son maximum, ce qui à son tour augmente le OCR. Enfin, avec l'ajout de deux inhibiteurs de la CTE (antimycine A et roténone), la respiration mitochondriale cesse complètement et OCR diminue à son niveau le plus bas. A ce niveau, la consommation d'oxygène est pas due à l'activité mitochondriale (non-mitochondrial). La différence de l'OCR générée par ces inhibiteurs est appelée la respiration mitochondriale maximale, qui est la somme de la respiration de la base et de la capacité de réserve. <pclass = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> B et isolements de cellules T donné populations de lymphocytes purs hautement viables. Les cellules B et les cellules T CD4 + naïfs ont été isolés comme décrit à la section 4 du protocole, et les splénocytes ont simplement été obtenus par la lyse des globules rouges comme décrit dans la section 3.3. La sensibilité des dosages cellulaires métaboliques spécifiques du type dépend de la viabilité et de la pureté de la population cellulaire de départ. Par conséquent, afin de vérifier la viabilité des cellules isolées de souris T, les splénocytes et les cellules B, et la pureté des lymphocytes T et B, les petites quantités aliquotes de cellules ont été colorées pour l' analyse par cytométrie de flux (Figure 2). Dans la dispersion-zone avant vs diffusion latérale-zone (FSC-A vs SSC-A) parcelle, les lymphocytes ont été bloqués, et à l'intérieur de cette porte, la population le long de la diagonale dans la dispersion-heigh avantt (FSC-H) vs. FSC Un tracé a été déterminé que les singulets. Au sein de la population de singlet, la viabilité a été mesurée par séparer les cellules qui coloraient négatif pour le marqueur direct / morts (figure 2A); T viabilité cellulaire était de 97,9%, la viabilité splénocytes a été de 92% et la viabilité des cellules B était de 94%. La pureté des lymphocytes B, telle que mesurée par le B220 + CD19 + 26 population, était de 99%, tandis que la pureté des lymphocytes T CD4 +, telle que mesurée par le CD44 – CD4 + population 27, était de 98,3% (figure 2B). La concentration en protéines du lysat cellulaire peut être utilisée comme un indicateur direct de la cellule numéro plaqué. Les lymphocytes et les splénocytes isolés ont été étalées dans une plaque d' essai de 96 puits encollée à 5 x 10 5 cellules / puits, 2,5 x 10 5 cellules / puits, de 1,25 x 10 5 cellules / puits, et 0,625 x 10 <sup> 5 cellules / puits. La confluence à chaque densité de placage des trois types de cellules a été visualisé sous le microscope optique (figure 3A). Comme on s'y attendait, la confluence en corrélation avec les densités d'étalement initial. A l'issue de l'analyse du flux extracellulaire, des cellules étalées ont été lysées et les concentrations de protéines ont été quantifiées en utilisant le dosage BCA. Pour tous les types de cellules, les concentrations en protéines de lysat ont été montrées pour être linéairement corrélée avec la densité de placage initiales (figure 3B), ce qui confirme que la concentration en protéines du lysat peut être utilisé comme une mesure précise de la normalisation du nombre de cellules dans l'interprétation des données de flux extracellulaire. Les densités de placage utilisées dans cette expérience ont été optimisées pour naïfs, les lymphocytes non stimulés. Si les cellules stimulées par ou préalablement cultivées sont utilisées, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire. Mitochondriale et stres glycolytiquess essais sont en fonction du nombre de cellules plaqué. RCO a été mesuré pour chaque type de cellule et la densité de placage dans l'analyseur de flux extracellulaire. Comme prévu, le nombre de cellules supérieur ont une OCR élevée mesurée, ainsi que les réponses les plus spectaculaires à l' oligomycine, le 2,4-DNP et l' antimycine A / roténone (figure 4A). Normaliser mesures OCR à la concentration en protéines de chaque échantillon révèle que, en général, un plus grand nombre de cellules conduisent à des mesures plus précises d'OCR. Placage à 5 et 2,5 x 10 5 cellules / puits ont donné lieu à des mesures OCR normalisées similaires dans les cellules T et les splénocytes, et 5 et 1,25 x 10 5 cellules / puits entraîné des mesures OCR normalisées similaires dans les cellules B (figure 4B). Les légères différences dans la cellule normalisée B mesures OCR peut être une indication indirecte que les cellules B réussissent mieux à 2,5 x 10 5 cellules / puits par rapport à d' autres densités cellulaires. Par toutes les mesures, 0,625 x 10 5 cellules / puits ont donné des résultats optimaux, ce qui démontre que cette densité de placage est insuffisante. La respiration de référence, la fuite de protons, la respiration mitochondriale maximale, la respiration mitochondriale non, et la production d' ATP linéairement corrélées avec des densités de placage pour tous les types de cellules (figure 4C). En outre, la majeure partie de la respiration de base est utilisée en direction de la synthèse de l'ATP, comme indiqué par la faible fuite de protons dans les trois types cellulaires. Bien que l'objectif principal de l'expérience du stress mitochondrial est de mesurer les changements dans l'OCR, l'ECAR est toujours utile d'enregistrer pour assurer que le test a été réalisé avec succès. Semblable à l'OCR, les deux densités de placage plus élevés ont donné lieu à ECAR supérieur et des réponses plus dramatiques à oligomycine, le 2,4-DNP et antimycine A / roténone (Figure 4D). Les changements dramatiques dans ECAR lors de l'addition de 2,4-DNP et antimycine A / roténone peuvent être dues à des changements dans la respiration en plus des changements de glycolysis, étant donné que le CO 2 produite au cours du cycle de TCA est converti en HCO 3 – et H +. Cette question a été récemment abordé, et il existe une méthode simple pour corriger le signal total d'acidification extracellulaire en utilisant les données de consommation d'oxygène, pour obtenir le taux réel de la glycolyse 12,29. L'essai de contrainte de la glycolyse est le plus réussi à la densité de placage la plus élevée (figure 5A, B). Dans tous les types de cellules, les échantillons de 5 x 10 5 cellules / puits ont les plus grands changements dans ECAR après l'addition de glucose, oligomycine, et le 2-DG (figure 5B). En outre, la normalisation de la concentration de protéine a démontré que pour tous les types de cellules, les 5 x 10 5 cellules / puits échantillons ont donné des résultats optimaux, tandis que les concentrations, surtout inférieures 0,625 x 10 5 cellules / bien ne pas afficher une capacité de réserve glycolytique robuste. Non glycolytic acidification, de la glycolyse, et de la capacité apparente glycolytique linéairement corrélées avec des densités de placage pour tous les types de cellules (figure 5C). Pour l'expérience de la contrainte de la glycolyse, le graphique ROC montre que le glucose stimule légèrement la respiration mitochondriale, qui est alors inhibée par le traitement oligomycine; l'addition de 2-DG n'a pas affecté l'OCR (figure 5D). Le graphique OCR peut être utilisé comme indicateur supplémentaire que l'expérience de la contrainte de la glycolyse a été réalisée avec succès. En outre, le graphique OCR peut être utilisé pour corriger le graphique ECAR, si nécessaire, comme expliqué ci – dessus dans le cas du test de stress mitochondrial 12,29. Figure 1:. Aperçu des analyses de flux extracellulaires (A) Illustration de la glycolyse ( à gauche) et la phosphorylation oxydative ( à droite) montrant l'action dules médicaments métaboliques utilisées dans les analyses de flux extracellulaire. (B) Schéma du taux d'acidification extracellulaire (ECAR) graphique; schématique du taux de consommation d'oxygène (OCR) graphique (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. . Figure 2: déclenchement par étapes des lymphocytes T, les lymphocytes B et les splénocytes pour déterminer la viabilité et de la pureté cytométrie de flux graphiques représentant la viabilité des cellules T, les splénocytes et les cellules B (A); et la pureté des lymphocytes T et B (B). Les résultats sont représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de thest la figure. Figure 3:. Cellulaire confluent en corrélation avec les concentrations de protéine de lysat de chaque type de cellule à différentes densités de placage (A) au microscope optique de cellules dans des puits de plaque de dosage , à des densités de placage allant de 5 x 10 5 cellules / puits pour 0,625 x 10 5 cellules / bien. Les barres d'échelle représentent 50 um. Les concentrations de protéine (B) lysat à différentes densités de placage, telle que mesurée par l'essai BCA. Les résultats sont représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Mitochondrial essai de stress. Bruts (A) et normalisée (B) OCR pour chaque type de cellule et la densité de placage sont représentés. (C) nombre dépendant cellulaires changements dans les niveaux de référence, mitochondriale maximale et la respiration mitochondriale non, ainsi que les consommations d'oxygène liés à la fuite de protons ou de la production d' ATP, sont indiqués pour chaque types de cellules. Valeurs (D) Raw ECAR obtenus à partir des tests de stress mitochondriales sont présentés. Chaque point de données représente la moyenne de 7-8 puits avec écart-type. flèches marquées représentent des injections de oligomycine (O), le 2,4-DNP (D), et la roténone / antimycine A (R / A). Les résultats sont représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. _upload / 54918 / 54918fig5.jpg "/> Figure 5:. Essai de stress glycolytique bruts (A) et normalisée (B) ECAR pour chaque type de cellule et la densité de placage sont représentés. (C) nombre dépendant cellulaires changements dans ECAR pour l' acidification non-glycolytique, la glycolyse induite par le glucose et la capacité totale de la glycolyse sont présentés. Valeurs (D) Raw OCR obtenus à partir des tests de résistance de la glycolyse sont présentés. Chaque point de données représente la moyenne de 7-8 puits avec écart-type. les flèches marquées indiquent des injections de glucose (G), oligomycine (O) et le 2-désoxyglucose (2-DG). Les résultats sont représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous avons développé le protocole a permis l'isolement efficace des sous-ensembles de lymphocytes purs et viables, qui ont ensuite été utilisés dans l'analyse du flux extracellulaire à différentes concentrations, afin d'évaluer les différences dans la glycolyse et la performance de la respiration mitochondriale. Ce protocole est conçu spécifiquement pour les lymphocytes et aborde les considérations particulières liées à ces types de cellules, comme une faible activité métabolique de base, de la fragilité, basse fréquence, et leur incapacité à adhérer à des plaques d'essai. Par conséquent, par rapport à des protocoles publiés précédemment 11,12, notre méthode offre un guide plus pratique et mieux optimisé pour les chercheurs travaillant dans le domaine de l' immunologie. Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, y compris l'obtention des populations de cellules pures et viables, plaquant les cellules à confluence optimale, et en normalisant les extracellulaires mesures d'analyse de flux à la concentration de protéine dans chaque puits.

inombre de cellules étalées préside d'abord pourrait à la fois être visualisées par microscopie optique et également être quantifiée en utilisant des mesures de concentration en protéines. La corrélation linéaire entre le nombre de cellules et la concentration en protéines a confirmé que la concentration de la protéine peut en effet être utilisé comme un moyen pour normaliser les effets des variations du nombre de cellules entre les différents puits.

En normalisant les résultats d' OCR ECAR et aux concentrations de protéine, nous avons montré que, malgré inférieure confluence des cellules, aussi peu que 2,5 x 10 5 cellules / puits pourraient être utilisés dans la plupart des dosages sans compromettre la qualité des données. Cependant, la limite inférieure de cellules qui peuvent être utilisés varient entre les types et les dosages cellulaires. Par exemple, tout en aussi peu que 1,25 x 10 5 cellules pourraient être utilisées pour cellules B mesures OCR, même 2,5 x 10 5 cellules / puits ne suffisaient pas pour évaluer la performance de la glycolyse du même type de cellule. Par conséquent, aussi longtemps que le nombre de cellules ne sont pas un facteur limitatif, le placage au-dessus90% de confluence, ce qui correspond approximativement à 5 x 10 5 lymphocytes / puits, est préférable. Une optimisation supplémentaire peut être requise lorsque des cellules de tailles différentes, telles que précédemment activés et des lymphocytes sont partiellement différenciées-utilisées. En outre, l'utilisation de lymphocytes primaires préalablement cultivées, il peut y avoir une variation de la viabilité cellulaire entre les différentes conditions de traitement, ce qui diminuerait la fiabilité de la concentration de protéine en tant que mesure du nombre de cellules mortes depuis ou les cellules mourantes peuvent également contribuer à la teneur en protéines mesurée . Dans de tels cas, il pourrait être utile pour trier les cellules vivantes par cytométrie en flux avant d'effectuer les analyses de flux extracellulaire.

Dans nos tests utilisant des populations de lymphocytes fraîchement isolés et très viables, nous avons obtenu des données fonctionnelles fiables pour les deux mesures de l'OCR et ECAR. Bien que tous les types de cellules se sont comportés de manière similaire dans le test de stress mitochondrial, des différences frappantes entre les types de cellules étaientobservée dans le test de stress de la glycolyse. Par exemple, la performance glycolytique des lymphocytes T naïfs était faible par rapport aux splénocytes ou les cellules B, et il n'a pas changé avec l'ajout d'oligomycine. Cette observation est conforme aux études publiées antérieurement 7,30, ce qui confirme la validité de notre protocole.

En conclusion, notre méthode offre un moyen efficace et pratique de tester l'activité métabolique des lymphocytes en utilisant un analyseur de flux extracellulaire, et il peut être utile dans un large éventail d'études immunologiques explorant les changements métaboliques dans les cellules immunitaires lors de l'activation, la différenciation cellulaire ou en raison à des phénotypes de maladies telles que l'infection, l'auto-immunité et les hémopathies malignes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

Materials

PBS (pH 7.2) Gibco-ThermoFisher 20012-050 To make MACS buffer
Bovine Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich A3803 To make MACS buffer
0.5M EDTA, pH 8 Quality Biological 10128-446 To make MACS buffer
autoMACS rinsing solution Miltenyi Biotec 130-091-222 Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.
RPMI-1640 Gibco-ThermoFisher 11875-093 Contains phenol red and L-glutamine
Fetal Bovine Serum Gibco-ThermoFisher 10437-028 For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. 
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) Gibco-ThermoFisher 15140-122 Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media.
L-Glutamine 200mM (L-Glut) Gibco-ThermoFisher 25030-081 Component of RF10 and stress test media
Sodium pyruvate 100mM Gibco-ThermoFisher 11360-070 Component of RF10 and stress test media
HEPES 1M Gibco-ThermoFisher 15630-080 Component of RF10
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco-ThermoFisher 11140-050 Component of RF10
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco-ThermoFisher 21985-023 Component of RF10
Falcon 70 μm cell strainer Falcon-Fischer Scientific 87712 Used in cell isolation
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip Covidien 8881513934 Used in cell isolation
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E Used in cell isolation
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed Partec CellTrics 04-004-2326 Used in cell isolation
B Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-862 Used in cell isolation
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-104-453 Used in cell isolation
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in cell isolation
MidiMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnet for separation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 Holder for magnets
autoMACS Rinsing Solution 130-091-222 Rinsing solution for autoMACS Pro Separator
autoMACS Pro Separator Instrument Miltenyi Biotec N/A
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375-5G
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) Sigma-Aldrich D198501
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis.
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 Follow manufacturer's instructions
Seahorse XFe96 FluxPak Seahorse Bioscience 101085-004 Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Seahorse XF Base Medium Seahorse Bioscience 102353-100 Used to prepare stress test media
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Seahorse Bioscience
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm EMD Millipore-Fisher Scientific SCGPU10RE Used to sterile filter media.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 487031 Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak.
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Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54918, doi:10.3791/54918 (2016).
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