Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de animales LIG-4, el cual fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NIAID. 1. Preparación de los reactivos Preparar tampón de separación magnética (MS): PBS (pH 7,2) suplementado con 0,5% de BSA y EDTA 2 mM o solución de separación automática suplementado con 0,5% de BSA. filtro estéril (0,22 m) y se almacena a 2-8 ° C. Preparar medio RF10: RPMI 1640 suplementado con suero fetal inactivado por calor 10% bovino, 50 U / ml de penicilina, 50 mM de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 50 mM 2 mercaptoetanol, HEPES 10 mM. Utilizar reactivos estériles. filtro estéril y se almacena a 2-8 ° C. Preparar mitocondrial medio de ensayo de estrés: medio de base XF suplementado con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 25 mM. Preparar medio de prueba de esfuerzo glucólisis: supplemen medio base XFted con 2 mM L-glutamina. Ajustar el pH de los medios de ensayo tanto mitocondrial y el estrés glucólisis a 7,4, filtro estéril y se almacena a 2-8 ° C. medios calientes a 37 ° C y volver a ajustar el pH antes de su uso (la medición de pH a 37 ° C). NOTA: El uso de medio XF, que carece de bicarbonato, es crítica. Dado que la atmósfera en el analizador de flujo extracelular contiene sólo CO ambiente 2, cualquier bicarbonato en el medio, tras la unión a protones liberados como un subproducto de la glucólisis, se disociará para formar CO 2 y agua. CO 2 se desgasifique durante el experimento, lo que provoca desviaciones en el pH que pueden dificultar la señal de la acidificación glucolítica. Preparar oligomicina: Preparar 10 mM solución madre en DMSO; almacenar a -20 ° C. Preparar 2,4-DNP: Preparar una solución 1 M en DMSO; almacenar a -20 ° C. Preparar antimicina A: Preparar 10 mM solución madre en DMSO; almacenar a -20 ° C. Preparar la rotenona: Preparar 10 mM stac solución en DMSO; almacenar a -20 ° C. Preparar la glucosa: disolver la glucosa en el medio de prueba de esfuerzo glucólisis para formar una solución 250 mM; preparar fresco antes de cada experimento y no congelar. Preparar 2-DG: Disolver 2-DG sólida en medio de ensayo de estrés glucólisis para formar una solución 500 mM; preparar fresco antes de cada experimento y no congelar. 2. La recolección bazo y nódulos linfáticos de ratones La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. Pulverizar el ratón con un 70% de etanol. Para el posterior aislamiento de células T, recoger el bazo, cervical superficial, axilar superficial / profundo, mandibular, inguinal, y los ganglios linfáticos mesentéricos. Para la posterior aislamiento de células B, la cosecha sólo el bazo. NOTA: Utilice un gabinete de bioseguridad y mantener los órganos cosechados en PBS o en medios RF10 en hielo hasta su procesamiento. Utilice el material de laboratorio estéril y una técnica estéril para todo el procesamiento y el aisladoración pasos. Mantenga todos los tampones y medios de comunicación en el hielo para aumentar la eficiencia y el aislamiento para reducir la muerte celular. 3. Procesamiento de tejidos Colocar un colador de 70 micras celular sobre un tubo cónico de 50 ml y transferir los órganos en el colador. Para el aislamiento de las células T, combine todos los órganos y para la transferencia de aislamiento de células B sólo el bazo. Usando el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triturar el tejido a través del filtro. Durante la maceración, asegúrese de que el filtro y los órganos son húmedo en todo momento y moje en caso necesario mediante la adición de tampón de MS. Esto tanto mantener la viabilidad celular alta y prevenir la obstrucción del filtro. Después de la maceración, aplicar 5-10 ml de tampón de MS al filtro para aumentar la recuperación celular. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. (Llevar a cabo todas las centrifugaciones posteriores en estas condiciones, a menos que se especifique). Se decanta el líquido y resuspender el precipitado en tampón de lisis de glóbulos rojos 5 ml ACK. Incubate durante 5 minutos en hielo para lisar las células rojas de la sangre (glóbulos rojos tienen que ser eliminado debido a que interfieren con la separación magnética). Añadir 10-20 ml de tampón y se centrifuga MS. Colocar un filtro de 30 micras de células en un tubo cónico de 15 ml y prepararlo con 1 ml de tampón MS (esta filtración eliminará los residuos de la lisis de los eritrocitos). Decantar el líquido desde el tubo de centrifugado, resuspender el precipitado en 5 ml de tampón MS y pasar a través del filtro. Lavar el tubo inicial con 4 ml de tampón de MS para aumentar la recuperación celular, y usar esto para enjuagar el filtro. El uso de un hemocitómetro o un contador de células automatizado, determinar el número total de células. Este número de células se utiliza para determinar la cantidad de reactivos de separación magnética requeridos en la Sección 4. Si esplenocitos se van a utilizar en el ensayo de flujo extracelular posterior, a un lado el número apropiado de células en este momento. Se centrifuga la suspensión y proceder a la separación magnética. esplenocitos Resuspender no utilizanpara el aislamiento de células B en 5 ml RF10 y mantener en hielo hasta que el ensayo de flujo extracelular. 4. La separación magnética de células B y células T naive CD4 + Determinar los volúmenes necesarios de cóctel de biotina-anticuerpo, microperlas anti-biotina, y el tampón de MS. Utilice los siguientes volúmenes de 10 8 células como guía y escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. NOTA: Se incuban las muestras en un refrigerador en lugar de en el hielo desde la incubación en hielo puede reducir la eficacia de la unión de anticuerpos y pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos. Reactivos para naïve separación de células T CD4 + Volumen por 10 8 células (escala apropiada) cóctel de biotina-anticuerpo 100 l MS tampón para primera incubación 400 l microperlas anti-biotina 200 l microperlas CD44 100 l MS tampón de incubación para la segunda 200 l Incubar el coctel y las células biotina-anticuerpo a 4 ° C durante 5 min. Añadir microperlas anti-biotina, microperlas CD44, MS tampón y se incuba a 4 ° C durante 15 min. Tabla 1: aislamiento de células T y las instrucciones. Reactivos para la separación de células B Volumen por 10 8 células (escala apropiada) cóctel de biotina-anticuerpo </td> 100 l MS tampón para primera incubación 400 l microperlas anti-biotina 200 l MS tampón de incubación para la segunda 300 l Incubar el coctel y las células biotina-anticuerpo a 4 ° C durante 15 min. Añadir el volumen apropiado de cóctel de biotina-anticuerpo y tampón de MS, y se incuba la mezcla a 4 ° C durante 15 min. Añadir el volumen apropiado de microperlas anti-biotina y MS tampón y se incuba la mezcla a 4 ° C durante 15 min. Después de la segunda incubación, llenar el tubo con tampón de MS y centrifugar. Tabla 2: aislamiento de células B y las instrucciones. Resuspender el sedimento en tampón MS: 500 l para la separación manual, 3-4 ml para la separación automática. Continuar con cualquiera de las separaciones manuales o automatizadoscomo sigue: Separación manual: Inserte una columna LS en el imán de la separación, colocar un tubo cónico de 15 ml estériles abajo para recoger el flujo a través, y cebar la columna lavando con 3 ml de tampón SM. Desechar el flujo a través. Transferir la suspensión celular a la columna de LS imprimado y permitir el paso de ésta; lavar el tubo utilizado durante la incubación con 3 ml de tampón de MS y pasar esto a través de la columna también. El eluato contendrá las células purificadas. Para el aislamiento de células B, pasar las células purificadas a través de la columna una segunda vez en un nuevo tubo de 15 ml, y repetir la etapa de lavado. Esto aumentará la pureza y el rendimiento. La separación automatizada: Encienda el separador automático y comprobar los niveles de funcionamiento de amortiguación, y la solución de etanol al 70% de enjuague. Asegúrese de que los residuos está vacía antes de iniciar la separación. Seleccione el estante refrigerado apropiado dependiendo del tamaño del tubo de tque la muestra no purificada (por ejemplo, 15 ml). Con el fin de mantener las células viables durante todo el proceso de separación, utilizar bastidores que no se ha enfriado previamente a 2-8 ° C durante 3-4 horas, o hasta que el líquido refrigerante se convierte en sólido. Montar el estante refrigerado en la etapa de la muestra del separador automático. Colocar el tubo de muestra en la ranura A1, un tubo para la fracción negativa en la ranura B1, y un tubo para la fracción positiva en C1. Si la recogida de más de una muestra, colocar tubos adicionales en los próximos columnas (A2, B2, C2, etc.). Seleccione la pestaña de separación en la pantalla táctil, e indicar la disposición de los tubos en el rack. En el menú de separación, seleccione el programa "agota" y completar el ciclo del programa con el tipo apropiado de lavado (ver nota más abajo). NOTA: El programa "agota" lleva a cabo el agotamiento usando el modo más sensible de la máquina, que da prioridad a la pureza. Además, hay tres opciones diferentes de lavado: QUICk enjuague, enjuague, y dormir. Si las muestras son de la misma fuente y se van a combinar, seleccione enjuague rápido. Si las muestras deben mantenerse separados, seleccione enjuague. Seleccionar la opción de suspensión si no hay otros aislamientos se llevarán a cabo ese día y si la máquina se apagará después del aislamiento Comience el aislamiento pulsando el botón "Ejecutar", y confirmar los niveles de amortiguación cuando se le solicite. Después de que el programa ha terminado, la fracción negativa contendrá células purificadas. Llenar el tubo cónico hasta 15 ml con MS tampón y se centrifuga. Decantar la MS tampón y volver a suspender las células en 5 ml de medio RF10. Mantener células en hielo hasta que el ensayo de flujo extracelular. NOTA: Idealmente, el ensayo de flujo extracelular debe llevarse a cabo inmediatamente después del aislamiento. Sin embargo, en experimentos preliminares no se observaron diferencias significativas en los resultados de ensayo en las células utilizadas dentro de 3 h de aislamiento frente a aislados recién queridos. <p class = "jove_title"> 5. Ensayo de flujo extracelular NOTA: El protocolo descrito aquí es para el formato de 96 pocillos del instrumento. Los volúmenes tendrán que ser ajustado si se utiliza otro formato. La hidratación del cartucho del sensor Levante el cartucho del sensor, llene cada pocillo de la placa de servicio con 200 l de solución de calibrado y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad, sumergiendo los sensores en la solución de calibrado. NOTA: Compruebe que el nivel de solución de calibrado es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos. El cartucho alberga fluoróforos asociados a O 2 y H + para cada pozo; estos deben ser hidratado con el fin de que funcionen correctamente. Coloque el cartucho en un 37 ° C incubadora no suplementado con CO 2 o de oxígeno / nitrógeno. Llevar a cabo todas las incubaciones adicionales en estas condiciones, a menos que se especifique. Incubar el cartucho durante la noche para hidratar. Preparación de placas recubiertas con adhesivo Preparar 2,5 ml de una solución de adhesivo de 22,4 mg / ml en bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0 (bicarbonato proporciona el pH óptimo para la adsorción del adhesivo). Aplicar 25 l de la solución a cada pocillo de la placa de ensayo, y se incuba en el banco a temperatura ambiente durante 20 min. adhesiva Aspirar y lavar cada pocillo dos veces con 200 l de agua estéril. Espere hasta que los pozos están secos antes de sembrar las células. La siembra de células en placas revestidas con adhesivo centrifugar las células a temperatura ambiente a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células en 5 ml de medio de ensayo adecuado (véase más arriba para la formulación de estrés mitocondrial y medios de comunicación de esfuerzo de glucosa). Centrifugar las células de nuevo y volver a suspender en la concentración deseada en medio de ensayo (volumen de resuspensión varían en función de la concentración; cada pocillo contendrá 180 l de suspensión celular). NOTA: Mientras los medios de ensayo adecuados y compuestos se utilizan, el analizador de flujo extracelular puede ejecutar simultáneamente las pruebas de estrés mitocondrial y la glucólisis en la misma placa. Placa de 180 l de suspensión celular en cada pocillo. Utilizar pozos A1, A12, H1 y H12 para el fondo de corrección de temperatura: añadir 180 l de medio de ensayo en estos pozos (sin células). Incubar las placas durante 25 min a 37 ° C. Centrifugar la placa a 200 xg durante 5 min sin freno para asegurar que todas las células han unido completamente. confirmar visualmente que las células se adhieren de forma estable a la superficie de cultivo, formando una monocapa, mediante la visualización en el microscopio. Transferir las placas de nuevo a la incubadora durante 30 min adicionales. Preparación de 10x concentraciones de compuestos, y carga de Puertos del inyector Para la prueba de estrés mitocondrial, preparar 2,5 ml cada una de 10 oligomicina mu M, mM DNP 1, y una mezcla de 10 mM y rotenona 10 mM antimicina A, todo en mitocondrial mediu ensayo de estrésmetro. NOTA: La concentración de 2,4-DNP se basa en estudios publicados anteriormente; 21 esto es una pauta general, pero la concentración de desacoplador para cada tipo de célula utilizado debe ser determinada por el investigador. Para la prueba de esfuerzo glucólisis, preparar 2,5 ml de cada una de glucosa 250 mM, 10 mM oligomicina, y 500 mM de 2-desoxiglucosa (2-DG) en medio de ensayo de estrés glucólisis. Cálidos 10x soluciones a 37 ° C, y ajustar el pH a 7,4. Cargar los compuestos en los puertos del inyector apropiadas del cartucho utilizando una micropipeta multicanal y las guías de carga, como sigue: Puerto Ensayo de estrés mitocondrial Ensayo de estrés glucólisis UN 20 l oligomicina 20 l de glucosa segundo 22 l de 2,4-DNP 22 l oligomicina do 25 l antimicina A / rotenona 25 l 2-DG Tabla 3: Compuesto. NOTA: Cada serie de puertos (por ejemplo, todos los puertos A) deben contener el mismo volumen. Es fundamental que todos los pocillos de una misma serie se cargan, incluso los que no se utiliza en el experimento, de lo contrario no serán inyectados los compuestos (puertos en los pocillos no utilizados pueden ser cargados con el mismo volumen de medio de ensayo). Incubar el cartucho de producir al instalar el programa. Configuración extracelular Ensayo de flujo de Protocolos Configurar el programa siguiente (Tabla 4). Paso Lazo </tr> Calibración – Equilibrio – lecturas de referencia 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min bucle End – Inyectar el puerto A – Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min bucle End – Inyectar el puerto B – Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min bucle End – Inyectar puerto C – Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, measure 3 min bucle End – Programa final – Tabla 4: Programa de diseño. NOTA: En ciertas condiciones, por ejemplo, cuando se utilizan células activadas, la acidificación puede continuar por más tiempo que en células de los animales. Por esta razón, puede ser necesario extender los tiempos de "espera" en el programa anterior o repetir cada ciclo de medición más veces. Iniciar el programa. Después de la etapa de calibración, vuelva a colocar la placa de compuesto de calibración de la placa de ensayo (cuando se le solicite). NOTA: El uso del software, es posible indicar los grupos de pozos que tienen condiciones similares. Además, es crucial para indicar cuales son los pozos de los pocillos de control (en este protocolo, que son las cuatro esquinas de la placa) y para indicar qué pozos están vacíos. Para un análisis más detallado, paso a paso, el protocolo para la creación de la máquina y ses de software, sitio web del fabricante debe ser consultado. La medición de contenido de proteínas Retire el medio de ensayo restante de cada bien sin molestar a las células. NOTA: Si no es conveniente para proceder con el ensayo de concentración de proteína, es posible congelar toda la placa a -20 ° C hasta su análisis. Si se congela, descongelar antes de continuar. Preparar una solución 1x de inhibidores de proteasa (100x de stock) en medio de lisis RIPA (suficiente para 50 l / pocillo). Añadir 50 l medio de lisis RIPA suplementado con inhibidores de la proteasa a cada pocillo. Agite la placa en un agitador durante 5 min, y luego se incuba la placa en hielo durante 30 min a células completamente lisan. Centrifuga la placa a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente para reducir los lípidos y otras moléculas a la parte inferior de la placa de manera que no interfieran con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Medir la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA según el fabricante y# 39; s recomendaciones.