Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de LIG-4 dier protocol, dat door de NIAID Animal Care en gebruik Comite werd goedgekeurd uitgevoerd. 1. Bereiding van reagentia Bereid magnetische scheiding (MS) buffer: PBS (pH 7,2) aangevuld met 0,5% BSA en 2 mM EDTA of automatische scheidingsoplossing aangevuld met 0,5% BSA. Steriel filter (0,22 pm) en opslag bij 2-8 ° C. Bereid RF10 medium: RPMI 1640 medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, 50 U / ml penicilline, 50 uM streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 50 pM 2 mercaptoethanol, 10 mM HEPES. Gebruik steriele reagentia. Steriel filter en bewaar bij 2-8 ° C. Bereid mitochondriale stresstest medium: XF basismedium gesupplementeerd met 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine en 25 mM glucose. Bereid glycolyse stresstest medium: XF basismedium vullendeted met 2 mM L-glutamine. De pH van zowel de mitochondriale en glycolyse stresstest media 7,4, steriel filter en bewaar bij 2-8 ° C. Warm media tot 37 ° C en opnieuw op pH vóór gebruik (pH verrichten metingen bij 37 ° C). OPMERKING: Met XF medium dat bicarbonaat mist, is kritisch. Omdat de atmosfeer in de extracellulaire flux analysator bevat slechts omgeving CO 2, elke bicarbonaat in het medium na binding aan protonen uitgebracht als een bijproduct van glycolyse, dissociëren tot CO2 en water. CO 2 ontgast tijdens het experiment, waardoor afwijkingen in pH dat de glycolytische verzuring signaal zou verduisteren. Bereid oligomycin: Bereid 10 mM voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. Bereid 2,4-DNP: Bereid 1 M voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. Bereid antimycin A: Bereid 10 mM voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. Bereid rotenon: Bereid 10 mM stock oplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. Bereid glucose: Los glucose in glycolyse stresstest medium om een ​​250 mM oplossing; vers bereid voor elk experiment en niet invriezen. Bereid 2-DG: Los solid 2-DG in glycolyse stresstest medium om een ​​500 mM oplossing te vormen; vers bereid voor elk experiment en niet invriezen. 2. Oogsten milt en de lymfeklieren van muizen Euthanaseren de muis door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit de muis met 70% ethanol. Voor de volgende T-cel isolatie, de oogst van de milt, oppervlakkige cervicale, oppervlakkige / diepe oksel, onderkaak, lies en mesenteriale lymfeklieren. Voor daaropvolgende B celisolatie, oogst alleen de milt. LET OP: Gebruik een bioveiligheid kast en houden de geoogste organen in PBS of RF10 media op ijs tot verwerking. Gebruik steriel laboratorium en steriele techniek voor alle verwerkingen en isolatie stappen. Houd alle buffers en media op ijs isolatie efficiëntie te verhogen en celdood te verminderen. 3. Weefsel bewerken Plaats een 70 um cel zeef in een 50 ml conische buis en de overdracht van de organen op de zeef. Voor T cel isolatie combineren alle organen en B celisolatie overdracht alleen de milt. Met de plunjer van een steriele 3 ml spuit, mash het weefsel door de zeef. Tijdens pureren, zorg ervoor dat het filter en de organen zijn vochtig te allen tijde en nat hen, zoals vereist door het toevoegen van MS buffer. Dit zal zowel de levensvatbaarheid van de cellen blijven hoog en verstopping van het filter te voorkomen. Na pureren, gelden 5-10 ml MS buffer om het filter naar cel herstel te vergroten. Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. (Voer alle verdere centrifugeren onder deze omstandigheden, tenzij anders aangegeven). Schenk de vloeistof en resuspendeer de pellet in 5 ml ACK rode bloedcel lysisbuffer. Incuverminder gedurende 5 min op ijs rode bloedcellen lyseren (rode bloedcellen moeten worden verwijderd omdat ze interfereren met de magnetische scheiding). Voeg 10-20 ml MS buffer en centrifuge. Plaats een 30 um cel filter over een 15 ml conische buis en vul het met 1 ml MS buffer (dit filtratie zal puin van de erytrocyten lysis te verwijderen). Schenk de vloeistof van de gecentrifugeerde buis, resuspendeer de pellet in 5 ml MS buffer en doorgeven door het filter. Was de eerste buis met 4 ml MS buffer naar cel herstel te verhogen, en dit gebruiken om het filter te spoelen. Met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter Bepaal het totale aantal cellen. Deze cel nummer wordt gebruikt om de hoeveelheid magnetische scheiding benodigde reagentia in punt 4. Indien splenocyten worden gebruikt in de daaropvolgende extracellulaire flux assay te bepalen, vernietiging van het juiste aantal cellen op dit moment. Centrifugeer de schorsing en ga verder met magnetische scheiding. Resuspendeer splenocyten niet gebruiktvoor B-cel isolatie in 5 ml RF10 en blijf op ijs tot de extracellulaire flux test. 4. Magnetische scheiding van B-cellen en naïeve CD4 + T-cellen Bepaal de benodigde hoeveelheden biotine-antilichaam cocktail, anti-biotine microbolletjes en MS buffer. Gebruik de volgende hoeveelheden van 10 8 cellen als richtlijn en vergroot of verkleind indien nodig. OPMERKING: Incubeer monsters in de koelkast niet op ijs sinds incuberen op ijs kan antilichaambinding efficiëntie en langere incubatietijden kunnen worden verlangd verminderen. Reagentia voor naïeve CD4 + T-celscheiding Volume 10 8 cellen (schaal adequaat) Biotine-antilichaam cocktail 100 gl MS buffer voor de eerste incubatie 400 gl Anti-biotine microkorrels 200 gl CD44 microbolletjes 100 gl MS buffer voor de tweede incubatie 200 gl Incubeer de biotine-antilichaam cocktail en cellen bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Add anti-biotine microbolletjes, CD44 microkralen, MS buffer en incuberen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Tabel 1: T cel isolatie volumes en instructies. Reagentia voor B celscheiding Volume 10 8 cellen (schaal adequaat) Biotine-antilichaam cocktail </td> 100 gl MS buffer voor de eerste incubatie 400 gl Anti-biotine microkorrels 200 gl MS buffer voor de tweede incubatie 300 gl Incubeer de biotine-antilichaam cocktail en cellen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Voeg de juiste hoeveelheid biotine-antilichaam cocktail en MS buffer en incuberen van het mengsel bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Voeg de juiste hoeveelheid anti-biotine microbolletjes en MS buffer en incuberen van het mengsel bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Na de tweede incubatie, vul de buis met MS buffer en centrifuge. Tabel 2: B celisolatie volumes en instructies. Resuspendeer de pellet in buffer MS: 500 pl voor handmatige scheiding, 3-4 ml voor automatische scheiding. Ga verder met handmatige of automatische scheidingenals volgt: Handmatig Scheiding: Plaats een LS kolom in de scheiding magneet plaatst onder een steriele 15 ml conische buis om de stroom door en de eerste kolom verzamelen door wassen met 3 ml buffer MS. Gooi de stroom door. Breng de celsuspensie aan het gegronde LS kolom en laat het passeren; was het buisje gebruikt tijdens de incubatie met 3 ml MS buffer en geven deze door de kolom ook. Het eluaat wordt de gezuiverde cellen bevatten. Voor de B-cel isolatie, passeren de gezuiverde cellen door de kolom voor de tweede keer in een nieuwe 15 ml buis en herhaal de wasstap. Dit zuiverheid en opbrengst te verhogen. Geautomatiseerde Scheiding: Schakel de automatische afscheider en controleer de niveaus van loopbuffer, spoeloplossing en 70% ethanol. Zorg ervoor dat het afval leeg is voordat de scheiding. Selecteer het juiste gekoeld rek afhankelijk van de buis grootte van tHij ongezuiverde monster (bijvoorbeeld 15 ml). Om de levensvatbare cellen gedurende het scheidingsproces te houden, gebruikt stellingen die eerder bij 2-8 ° C gedurende 3-4 uur gekoeld, of totdat de koelvloeistof vaste stof. Monteer de gekoelde rek op het monster etappe van de automatische afscheider. Plaats de monsterbuis in slot A1, een buis voor de negatieve fractie slot B1, en een buis voor de positieve fractie C1. Wanneer verzamelen meer dan één monster, plaatst extra buizen in de volgende kolommen (A2, B2, C2, etc.). Selecteer het tabblad scheiding op het touchscreen, en geven de plaatsing van buizen op het rek. Vanuit het menu scheiding, selecteer het programma "put" en vul het programma cyclus met het juiste type van wassen (zie opmerking hieronder). LET OP: Het programma "put" voert uitputting behulp van meest gevoelige modus van de machine, die de zuiverheid prioriteit. Daarnaast zijn er drie verschillende wassen opties: quick spoelen, spoelen, en slapen. Indien de monsters uit dezelfde bron en worden samengevoegd, selecteert snelle spoelen. Als de monsters gescheiden moeten worden gehouden, selecteert spoelen. Selecteer de optie slaapstand als er geen verdere isolaties die dag zal worden uitgevoerd en als de machine zal worden afgesloten na isolatie Begin de isolatie door te drukken "Run" en bevestig de buffer levels als daarom wordt gevraagd. Nadat het programma is afgelopen, zullen de negatieve fractie gezuiverde cellen bevatten. Vul het conische buis tot 15 ml met MS buffer en centrifugeer. Giet het MS buffer en resuspendeer cellen in 5 ml RF10 media. Houd cellen op ijs tot de extracellulaire flux assay. OPMERKING: Idealiter het extracellulaire flux bepaling worden onmiddellijk na isolatie uitgevoerd. In voorlopige experimenten geen significante verschillen in bepalingsbuffer resultaten werden waargenomen in cellen die binnen 3 hr isolatie versus vers geïsoleerde degenen. <p class = "jove_title"> 5. Extracellulaire Flux Assay OPMERKING: Het protocol hier beschreven is aan de 96-well formaat van het instrument. Volumes moeten worden aangepast als een ander formaat wordt gebruikt. Hydratatie van Sensor Cartridge Til de sensorcartridge, vul elk putje van het nut plaat met 200 ul kalibrant oplossing en laat de sensorcartridge op het nut plaat, kopje onder de sensoren in de kalibrant oplossing. LET OP: Controleer of het kalibratieoplossing niveau is hoog genoeg om de sensoren onder water te houden. De patroon herbergt fluoroforen geassocieerd O 2 en H + voor elk putje; deze moeten worden gehydrateerd, zodat zij goed werken. Plaats de patroon in een 37 ° C incubator niet aangevuld met CO 2 of zuurstof / stikstof. Verricht alle verdere incubaties onder deze omstandigheden, tenzij anders aangegeven. Incubeer de cartridge 's nachts te hydrateren. preparatie van Adhesive-coated Plates Bereid 2,5 ml van een 22,4 mg / ml hechtende oplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 8,0 (bicarbonaat bepaalt de optimale pH voor kleefstof adsorptie). Toepassen 25 ul van de oplossing in elk putje van de testplaat, en incubeer de bank bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Zuig lijm en was elk putje twee keer met behulp van 200 ui steriel water. Wacht tot putten droog zijn voor het zaaien van de cellen. Zaaien Cellen in-Adhesive gecoate platen Centrifugeer cellen bij kamertemperatuur bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 5 ml van de geschikte bepaling (zie hierboven voor bereiding van mitochondriale stress en glucosebelastingstest media). Centrifuge cellen opnieuw en resuspendeer in de gewenste concentratie in testmedium (resuspensie volume zal variëren op basis van de concentratie; elk putje wordt 180 pi celsuspensie bevatten). OPMERKING: Zolang de geschikte test media en verbindings worden gebruikt, de extracellulaire flux analyzer kan gelijktijdig de mitochondriale en glycolyse stresstests op dezelfde plaat. Plaat 180 gl celsuspensie in elk putje. Gebruik putten A1, A12, H1, en H12 voor achtergrond temperatuurcorrectie: voeg 180 ul assay medium in deze putten (geen cellen). Incubeer de platen gedurende 25 min bij 37 ° C. Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten zonder rem zodat alle cellen volledig zijn bevestigd. Visueel bevestigen dat de cellen die stabiel zijn gehecht aan het cultuur oppervlak, waarbij een monolaag, door het bekijken onder de microscoop. Breng de plaat terug in de incubator gedurende nog 30 min. Bereiding van 10x concentraties van verbindingen en laden van injectorpoorten Voor de mitochondriale stresstest bereiden 2,5 ml van 10 uM oligomycin, 1 mM DNP en een mengsel van 10 uM en 10 uM rotenon antimycin A, alle in mitochondriale spanning assay medium. Opmerking: De concentratie van 2,4-DNP is gebaseerd op eerder gepubliceerde studies, 21 dit is een algemene richtlijn maar de concentratie ontkoppelaar voor elk gebruikte celtype worden bepaald door de onderzoeker. Voor de glycolyse stress test, voor te bereiden 2,5 ml van 250 mM glucose, 10 uM oligomycin en 500 mM 2-deoxyglucose (2-DG) in glycolyse stress-test medium. Warm 10x oplossingen tot 37 ° C en de pH instellen op 7,4. Laad de verbindingen in de juiste injectorpoorten van de patroon met een multichannel micropipettor en het laden geleiders, als volgt: Haven Mitochondriale Stress Assay Glycolyse Stress Assay EEN 20 gl oligomycin 20 pi glucose B 22 ui 2,4-DNP 22 ul oligomycin C 25 gl antimycin A / rotenon 25 ui 2-DG Tabel 3: Verbinding volumes. OPMERKING: Elke reeks poorten (bijvoorbeeld alle poorten A) moet hetzelfde volume bevatten. Het is essentieel dat alle putjes in een bepaalde serie worden geplaatst, ook als deze niet gebruikt in het experiment, anders zullen de verbindingen niet worden geïnjecteerd (poorten in ongebruikte bronnen kan worden geladen met hetzelfde volume testmedium). Incubeer de cartridge tijdens het opzetten van het programma. Opstellen Extracellulaire Flux Assay Protocollen Stel de volgende programma (tabel 4). Stap Lus </tr> ijking – evenwicht – Baseline lezingen 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min einde lus – Injecteren Port A – Afmetingen 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min einde lus – Injecteren Port B – Afmetingen 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min einde lus – Injecteren Port C – Afmetingen 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, MEASURe 3 min einde lus – einde Programma – Tabel 4: Program lay-out. OPMERKING: In bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld bij het gebruik van geactiveerde cellen, de verzuring kunnen blijven langer dan bij niet eerder behandelde cellen. Daarom kan het nodig zijn de "wacht" tijd in het programma elke meetcyclus keer verlengen of herhalen. Begin het programma. Na de kalibratie stap, vervangt de kalibrant plaat voor de testplaat (als daarom wordt gevraagd). OPMERKING: Gebruik van de software, is het mogelijk om groepen van putjes die soortgelijke voorwaarden geven. Daarnaast is het van cruciaal belang om aan te geven welke bronnen de controle putten zijn (in dit protocol, zijn ze de vier hoeken van de plaat) en aan te geven welke putten leeg zijn. Voor een meer gedetailleerde, stap-voor-stap protocol voor het instellen van de machine en hets software, dient de website van de fabrikant worden geraadpleegd. Het meten van het eiwitgehalte Verwijder het resterende assay medium uit elk putje zonder de cellen. Opmerking: Als het niet handig te gaan met de eiwitconcentratie assay, kan men de gehele plaat invriezen bij -20 ° C tot analyse. Indien bevroren, ontdooien alvorens verder te gaan. Bereid een 1x oplossing van proteaseremmers (100x voorraad) in RIPA lysis medium (voldoende voor 50 pl / putje). Voeg 50 ul RIPA lysis medium aangevuld met proteaseremmers aan elk putje. Schud plaat op een schudder gedurende 5 min, en vervolgens incubeer plaat op ijs gedurende 30 minuten volledig te lyseren cellen. Draai de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur lipiden en andere moleculen aan de onderzijde van de plaat te brengen zodat ze niet interfereren met de bicinchoninezuur (BCA) assay. Meet eiwitconcentratie door BCA assay volgens de fabrikant &# 39; s aanbevelingen.