Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8⁺ Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

CD8 ⁺ Т-клетки содержат важнейший компонент адаптивной иммунной системы , поскольку они участвуют в опухоли иммунного надзора и способствовать искоренению внутриклеточных патогенов ^1. Проще говоря, CD8 ⁺ Т-клетки экспрессируют рецепторы Т-клеток (TCR) , которые специфически распознают пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) молекулы , присутствующие на плазматической мембране клеток – хозяев. Так как эти пептиды являются производными от протеолиза эндогенно синтезированных белков, клеточной поверхности ПКИКЖ-I комплексы обеспечивают окно в внутриклеточной среде. При вирусной инфекции, например, инфицированные клетки будут отображать молекулы MHC-I , содержащих вирусные производные пептидов , которые могут служить в качестве лигандов для ТКР , выраженные патрулируя CD8 ⁺ Т-клеток. В случае вирус-специфических CD8 ⁺ Т-клетка встречается инфицированной клетки представляет свои ПКИКЖ-I – лиганд, ТКР взаимодействие будет приводить к активации ⁺ Т-клеток CD8 и ULTIзительно приводят к целевой лизис клеток. Учитывая критический характер этих взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, определение величины, специфичность и фенотип реагирования CD8 ⁺ Т-клетки часто могут выявить важные подсказки о заболеваниях человека.

До начала 1990 – х годов, количественное определение Ag-специфических CD8 ⁺ Т-клеток не полагались на технически сложных предельного анализа разбавления (LDA) ^2,3. Мало того, что LDA требуется несколько дней, чтобы завершить, он также не удалось обнаружить клетки, которые испытывали недостаток пролиферативный потенциал. В результате, ЛДА значительно недооценивают реальную частоту антигена (Ag) -специфические CD8 ⁺ Т-клеток , участвующих в иммунной реакции. Хотя развитие ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокина анализов значительно улучшило способность измерить клеточный иммунитет, эти методы все еще требуется в пробирке стимуляции для количественной оценки антиген-специфические Т-клетки ^4. Он не был до 1996 года, что Альтман, Дэвис, и сбeagues опубликовал свою основополагающую статью , сообщающее развитие технологии ПКИКЖ-I тетраметра ^5. Критическое значение для успеха этого метода была мультимеризация молекул ПКИКЖ-I, что привело к увеличению полураспада взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, тем самым снижая вероятность тетрамеров ПКИКЖ-I падает во время стадии промывки в проточной цитометрии анализов. Главное преимущество тетра- ПКИКЖ- класса над вышеупомянутыми анализов является способность точно обнаружить антиген-специфические CD8 ⁺ Т-клетки непосредственно ех естественных условиях без необходимости экстракорпорального повторной стимуляции. Кроме того, сочетание тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I с многоцветной проточной цитометрии позволило подробный анализ стадии дифференцировки, фенотип памяти и статус активации Ag-специфических CD8 ⁺ Т-клеток ^2-4. В свете последних технических достижений для характеристики CD8 ⁺ Т-клеток с помощью репертуаров рМНС-I мультимеру окрашивания ^6, широту применения Foг эта методология, вероятно, продолжит расширяться.

Мало областей в биомедицинских исследованиях получили пользу больше от тетрамера окрашивания ПКИКЖ-I , чем области ВИЧ иммунологии ^7. Хотя CD8 ⁺ Т-клетки были временно связаны с начальным контролем виремии ВИЧ к моменту публикации Альтман, Дэвис и его коллеги ^8,9, использование тетрамеров ПКИКЖ-I в последующие годы значительно расширили наше понимание ВИЧ-специфических CD8 ⁺ Т-клеточный ответ. Например, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания помог подтвердить надежный размер вирус-специфических ответов CD8 ⁺ Т-клеток у большинства ВИЧ-инфицированных лиц ^10-12. Эта методика также способствовала характеристика ВИЧ и SIV-специфических Т-клеточных реакций CD8 ⁺ ограниченное молекулами MHC-I , связанных с самопроизвольным контролем репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии-явление , известное как "элитный контроль" <suр> 13-15. Кроме того, тетрамеры ПКИКЖ-I сыграли важную роль в создании оси запрограммированной смерти 1 (PD-1) / PD – лиганд 1 (PD-L1) в качестве обратимого пути для дисфункциональной фенотипа ВИЧ-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в неконтролируемой хронической инфекции ^16,17. В совокупности эти исследования подчеркивают полезность тетрамеров ПКИКЖ-I для мониторинга ответов CD8 ⁺ Т-клеток против вируса СПИДа.

Экспериментальная SIV инфекции макак – резусов (Macaca мулатка) остается лучшей животной моделью для оценки иммунного вмешательства против ВИЧ / СПИДа ^18,19. За последние 25 лет достигнут значительный прогресс был достигнут в области идентификации и определения характеристик SIV-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в этой обезьяны видов, в том числе открытие аллели MHC-I и определения пептидсвязывающий мотивов ^13,20-27 , В результате, тетрамеры ПКИКЖ-I были разработаны для анализа SIV-специфических CD8 ⁺ Т-клетокответы в этой животной модели ^28. Большинство из этих реагентов изготовлены из генных продуктов из четырех макак резус аллелями MHC-I: Маму-А1 * 001, Маму-А1 * 002: 01, Маму-B * 008: 01, и Маму-B * 017: 01. Следует отметить, что макак не выражают локус MHC-C ^29. Подавляющее большинство из тетрамеров ПКИКЖ-I, используемые в настоящих экспериментах были произведены на NIH тетрамеров основной комплекс в Университете Эмори. Тем не менее, некоторые из этих реагентов, в том числе Маму-A1 * 001 тетрамеров связанных с иммунодоминантном Gag CM9 эпитоп, могут быть получены только из коммерческих источников, из-за лицензионных соглашений. Использование тетрамеры ПКИКЖ-I из четырех макак резус аллелями , перечисленных выше, мы успешно перечислены CD8 ⁺ Т-клеток против в общей сложности 21 SIV эпитопов (таблица 1), которые были вызваны вакцинацией или первичной инфекции SIV ^30,31 (Мартинс и др и др., неопубликованные данные).

Настоящая рукопись обеспечиваетоптимизированный протокол тетрамер окрашивания ПКИКЖ-я для определения частоты и памяти фенотип ВИО-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в макак – резусов. Анализ начинается с факультативный 30 мин инкубации с ингибитором протеинкиназы (ИПК, здесь используется Дазатиниб) с целью уменьшения интернализации ТКР и тем самым улучшить ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания ^32. Как описано ниже, эта процедура особенно полезна при использовании Маму-B * 017: 01 тетрамеров. Также предоставляются инструкции о том, как маркировать клетки с флуорохромом конъюгированный тетрамеров ПКИКЖ-I и моноклональных антител (мАт). Этот протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного обнаружения цитолиза-ассоциированной молекулы гранзимом (GZM B). Моноклональное антитело против CD3 добавляется на этом этапе, а также улучшить обнаружение этой сигнальной молекулы TCR. В качестве ссылки, все флуорохромы, используемые в этом окрашивающим панели перечислены.