Summary

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup> +</sup> Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Published: December 23, 2016
doi:

Summary

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для нумерации и характеризующих макаки – резус CD8 + Т – клеток против вируса СПИДа. Эта статья полезна не только к области иммунологии ВИЧ, но и в других областях биомедицинских исследований , где ответы CD8 + Т – клеток , как известно, влияют на исход заболевания.

Abstract

Пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) тетрамеры был бесценным инструментом для изучения ответов CD8 + Т-клеток. Поскольку эти реагенты непосредственно связываются с рецепторами Т-клеток на поверхности CD8 + Т-лимфоцитов, Флуорохром-меченых тетрамеров ПКИКЖ-I позволяют точное обнаружение антигена (Ag) -специфический CD8 + Т-клетки без необходимости повторной ин витро -стимуляция. Кроме того, в сочетании с многоцветной проточной цитометрии, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивание может выявить ключевые аспекты Ag-специфических CD8 + Т-клеток, в том числе стадии дифференцировки, фенотипом памяти, а также состояние активации. Эти виды анализов были особенно полезны в области иммунологии ВИЧ , где CD8 + Т-клетки могут влиять на развитие СПИДа. Экспериментальное заражение макак-резусов с вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО) является бесценным инструментом для изучения клеточного иммунитета против вируса СПИДа. В результате значительная PROGRESS было сделано в определении и характеризующее Т-клеточного ответа в данной животной модели. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для перечисления SIV-специфических CD8 + T-клеток в макак-резусов с помощью окрашивания тетрамера ПКИКЖ-I. Наш анализ позволяет одновременно количественной оценки и памяти Фенотипирование двух популяций ПКИКЖ-I тетрамер + CD8 + T-клеток на тест, что может быть полезно для отслеживания SIV-специфических Т-клеточного ответа CD8 + , сгенерированные с помощью вакцинации или SIV инфекции. Учитывая актуальность приматах в биомедицинских исследованиях, эта методика применима для изучения ответов CD8 + Т-клеток в различных условиях болезни.

Introduction

CD8 + Т-клетки содержат важнейший компонент адаптивной иммунной системы , поскольку они участвуют в опухоли иммунного надзора и способствовать искоренению внутриклеточных патогенов 1. Проще говоря, CD8 + Т-клетки экспрессируют рецепторы Т-клеток (TCR) , которые специфически распознают пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I (ПКИКЖ-I) молекулы , присутствующие на плазматической мембране клеток – хозяев. Так как эти пептиды являются производными от протеолиза эндогенно синтезированных белков, клеточной поверхности ПКИКЖ-I комплексы обеспечивают окно в внутриклеточной среде. При вирусной инфекции, например, инфицированные клетки будут отображать молекулы MHC-I , содержащих вирусные производные пептидов , которые могут служить в качестве лигандов для ТКР , выраженные патрулируя CD8 + Т-клеток. В случае вирус-специфических CD8 + Т-клетка встречается инфицированной клетки представляет свои ПКИКЖ-I – лиганд, ТКР взаимодействие будет приводить к активации + Т-клеток CD8 и ULTIзительно приводят к целевой лизис клеток. Учитывая критический характер этих взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, определение величины, специфичность и фенотип реагирования CD8 + Т-клетки часто могут выявить важные подсказки о заболеваниях человека.

До начала 1990 – х годов, количественное определение Ag-специфических CD8 + Т-клеток не полагались на технически сложных предельного анализа разбавления (LDA) 2,3. Мало того, что LDA требуется несколько дней, чтобы завершить, он также не удалось обнаружить клетки, которые испытывали недостаток пролиферативный потенциал. В результате, ЛДА значительно недооценивают реальную частоту антигена (Ag) -специфические CD8 + Т-клеток , участвующих в иммунной реакции. Хотя развитие ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокина анализов значительно улучшило способность измерить клеточный иммунитет, эти методы все еще требуется в пробирке стимуляции для количественной оценки антиген-специфические Т-клетки 4. Он не был до 1996 года, что Альтман, Дэвис, и сбeagues опубликовал свою основополагающую статью , сообщающее развитие технологии ПКИКЖ-I тетраметра 5. Критическое значение для успеха этого метода была мультимеризация молекул ПКИКЖ-I, что привело к увеличению полураспада взаимодействий TCR / ПКИКЖ-I, тем самым снижая вероятность тетрамеров ПКИКЖ-I падает во время стадии промывки в проточной цитометрии анализов. Главное преимущество тетра- ПКИКЖ- класса над вышеупомянутыми анализов является способность точно обнаружить антиген-специфические CD8 + Т-клетки непосредственно ех естественных условиях без необходимости экстракорпорального повторной стимуляции. Кроме того, сочетание тетрамер окрашивания ПКИКЖ-I с многоцветной проточной цитометрии позволило подробный анализ стадии дифференцировки, фенотип памяти и статус активации Ag-специфических CD8 + Т-клеток 2-4. В свете последних технических достижений для характеристики CD8 + Т-клеток с помощью репертуаров рМНС-I мультимеру окрашивания 6, широту применения Foг эта методология, вероятно, продолжит расширяться.

Мало областей в биомедицинских исследованиях получили пользу больше от тетрамера окрашивания ПКИКЖ-I , чем области ВИЧ иммунологии 7. Хотя CD8 + Т-клетки были временно связаны с начальным контролем виремии ВИЧ к моменту публикации Альтман, Дэвис и его коллеги 8,9, использование тетрамеров ПКИКЖ-I в последующие годы значительно расширили наше понимание ВИЧ-специфических CD8 + Т-клеточный ответ. Например, ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания помог подтвердить надежный размер вирус-специфических ответов CD8 + Т-клеток у большинства ВИЧ-инфицированных лиц 10-12. Эта методика также способствовала характеристика ВИЧ и SIV-специфических Т-клеточных реакций CD8 + ограниченное молекулами MHC-I , связанных с самопроизвольным контролем репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии-явление , известное как "элитный контроль" <suр> 13-15. Кроме того, тетрамеры ПКИКЖ-I сыграли важную роль в создании оси запрограммированной смерти 1 (PD-1) / PD – лиганд 1 (PD-L1) в качестве обратимого пути для дисфункциональной фенотипа ВИЧ-специфических CD8 + Т-клеток в неконтролируемой хронической инфекции 16,17. В совокупности эти исследования подчеркивают полезность тетрамеров ПКИКЖ-I для мониторинга ответов CD8 + Т-клеток против вируса СПИДа.

Экспериментальная SIV инфекции макак – резусов (Macaca мулатка) остается лучшей животной моделью для оценки иммунного вмешательства против ВИЧ / СПИДа 18,19. За последние 25 лет достигнут значительный прогресс был достигнут в области идентификации и определения характеристик SIV-специфических CD8 + Т-клеток в этой обезьяны видов, в том числе открытие аллели MHC-I и определения пептидсвязывающий мотивов 13,20-27 , В результате, тетрамеры ПКИКЖ-I были разработаны для анализа SIV-специфических CD8 + Т-клетокответы в этой животной модели 28. Большинство из этих реагентов изготовлены из генных продуктов из четырех макак резус аллелями MHC-I: Маму-А1 * 001, Маму-А1 * 002: 01, Маму-B * 008: 01, и Маму-B * 017: 01. Следует отметить, что макак не выражают локус MHC-C 29. Подавляющее большинство из тетрамеров ПКИКЖ-I, используемые в настоящих экспериментах были произведены на NIH тетрамеров основной комплекс в Университете Эмори. Тем не менее, некоторые из этих реагентов, в том числе Маму-A1 * 001 тетрамеров связанных с иммунодоминантном Gag CM9 эпитоп, могут быть получены только из коммерческих источников, из-за лицензионных соглашений. Использование тетрамеры ПКИКЖ-I из четырех макак резус аллелями , перечисленных выше, мы успешно перечислены CD8 + Т-клеток против в общей сложности 21 SIV эпитопов (таблица 1), которые были вызваны вакцинацией или первичной инфекции SIV 30,31 (Мартинс и др и др., неопубликованные данные).

Настоящая рукопись обеспечиваетоптимизированный протокол тетрамер окрашивания ПКИКЖ-я для определения частоты и памяти фенотип ВИО-специфических CD8 + Т-клеток в макак – резусов. Анализ начинается с факультативный 30 мин инкубации с ингибитором протеинкиназы (ИПК, здесь используется Дазатиниб) с целью уменьшения интернализации ТКР и тем самым улучшить ПКИКЖ-я тетрамер окрашивания 32. Как описано ниже, эта процедура особенно полезна при использовании Маму-B * 017: 01 тетрамеров. Также предоставляются инструкции о том, как маркировать клетки с флуорохромом конъюгированный тетрамеров ПКИКЖ-I и моноклональных антител (мАт). Этот протокол также включает в себя этап проницаемости клеточной мембраны для внутриклеточного обнаружения цитолиза-ассоциированной молекулы гранзимом (GZM B). Моноклональное антитело против CD3 добавляется на этом этапе, а также улучшить обнаружение этой сигнальной молекулы TCR. В качестве ссылки, все флуорохромы, используемые в этом окрашивающим панели перечислены.

Protocol

В мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцы, используемые в этой рукописи были получены из индийских макак хранящаяся в Национальном исследовательском центре приматов Висконсин. Эти животные были воспитывающихся в соответствии с отчетом Weatherall согласно протоколу , утвержденному…

Representative Results

Протокол , описанный здесь , был использован для определения величины и памяти фенотип поствакцинальный, Gag CM9-специфических ответов CD8 + Т-клеток в Маму-A1 * 001 + макаки – резус. Для этого анализа, БТР-конъюгирован Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 тетрамер был использован в 8-цветной …

Discussion

Несколько шагов в этой процедуре заслуживают обсуждения, поскольку они имеют решающее значение для приносит оптимальные результаты. Во- первых, поскольку качество биологических образцов является сильным прогностическим фактором успеха любого потока цитометрии анализа 38, все н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Уоткинса за поддержку экспериментов, которые позволили оптимизировать существующей методологии. В исследовании, опубликованном в данной публикации, была частично поддержана пилотным гранта, предоставленного Майами Центром исследований в области СПИДа Национальных институтов здравоохранения под номером награду P30AI073961. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Materials

Dasatinib Axon medchem Axon 1392 Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C
RPMI w/ Glutamax gibco/ Life Technologies 61870-036 Must be stored at 4 °C 
Heat Inactivated FBS gibco/ Life Technologies 10082-147 Must be stored at 4 °C 
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B Lonza 17-745E Must be stored at 4 °C 
DMSO, Anhydrous Life Technologies D12345 Store at room temperature.
5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes VWR 60819-728
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers NIH Tetramer Core or MBL, Inc. Must be stored and maintained at  4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.
Fluorochrome-conjugated mAbs Various companies Must be stored and maintained at  4 °C. Do not freeze.
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies l34957 Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use.
Brilliant Stain Buffer BD Biosciences 563794 Must be stored at  4 °C 
Phosphate Buffered Saline VWR 97064-158 Store at room temperature
Albumine Bovine VWR 700011-230 Must be stored at  4 °C 
Sodium Azide VWR 97064-646 Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.
Bleach VWR 89501-620 Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care
Polysorbate 20 (Tween-20) Alfa Aesar L15029 Store at room temperature
Permeabilization Solution 2  BD Biosciences 340973 Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Sarsdet Tubes 1.5mL screw top VWR 72.692.005
2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes Eppendorf 22431048 The use of Sterile microtubes is preffered 
Vortex mixer To discretion of scientist
Biosafety Cabinet  To discretion of scientist
Milli Q Intergral Water Purification system EMD Millipore ZRXQ010WW Molecular Biology grade water from any provider may be used
Microcentrifuge To discretion of scientist
Centrifuge To discretion of scientist
4 °C  refrigerator To discretion of scientist
BD LSR II BD Biosciences Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Deionized water
Aluminum Foil VWR SCIENTIFIC INC. 89068-738
Incubator Must be able to maintain 37 °C  internal temperature
FACS Diva software BD Biosciences
Flowjo software version 9.6 Flowjo Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software
Micropippette tips

References

  1. Parham, P., Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. , 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with “escaped” virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. . The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. , 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gonzalez-Nieto, L., Domingues, A., Ricciardi, M., Gutman, M. J., Maxwell, H. S., Pedreño-Lopez, N., Bailey, V., Magnani, D. M., Martins, M. A. Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining. J. Vis. Exp. (118), e54881, doi:10.3791/54881 (2016).

View Video