Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8⁺ T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

CD8 ⁺ T-cellen een belangrijke component van het adaptieve immuunsysteem voor deelname tumor immune surveillance en dragen bij aan de uitroeiing van intracellulaire pathogenen ^1. Eenvoudig gezegd, CD8 ⁺ T-cellen brengen T-celreceptoren (TCR's) die specifiek herkennen peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) moleculen aanwezig op het plasmamembraan van gastheercellen. Omdat deze peptiden zijn afgeleid van de proteolyse van endogeen gesynthetiseerde eiwitten, celoppervlak pMHC-I complexen een venster in de intracellulaire omgeving. Na virusinfectie, bijvoorbeeld geïnfecteerde cellen MHC-I moleculen die virus afgeleide peptiden die als liganden voor door TCR patrouilleren CD8 ⁺ T-cellen tot expressie kunnen dienen weergeven. Bij een virus-specifieke CD8 ⁺ T-cel tegenkomt een geïnfecteerde cel presenteert het pMHC-I ligand, zal TCR betrokkenheid resulteren in CD8 ⁺ T-cel activatie en ultiveer leiden tot cellysis richten. Gezien het grote belang van deze TCR / pMHC-I interacties bepalen de grootte, specificiteit en fenotype reageren CD8 ⁺ T-cellen vaak kunnen belangrijke aanwijzingen over menselijke ziektes.

Tot begin 1990 kwantificering van Ag-specifieke CD8 ⁺ T-cellen gebruikt de technisch veeleisende beperkende verdunningstest (LDA) ^2,3. Niet alleen heeft de LDA vereisen een aantal dagen worden afgerond, maar ook nagelaten om cellen die proliferatieve potentiële ontbrak op te sporen. Hierdoor LDA sterk onderschat de werkelijke frequentie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 ⁺ T-cellen die aan een immuunrespons. Hoewel de ontwikkeling van ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring assays sterk het vermogen om cellulaire immuniteit meten verbeterde Deze methoden verzet in vitro stimulatie te kwantificeren Ag-specifieke T-cellen ^4. Het was pas in 1996 dat Altman, Davis, en colleagues publiceerden hun landmark artikel rapporteren van de ontwikkeling van de pMHC-I tetrameer technologie ^5. Cruciaal voor het succes van deze techniek was de multimerisatie van pMHC-I moleculen die de halfwaardetijd van TCR / pMHC-I interacties uitgebreid, waardoor de kans op pMHC-I tetrameren vallen tijdens de wasstappen van flowcytometrische assays verminderen. Het belangrijkste voordeel van pMHC-I tetrameren via voornoemde assays is de mogelijkheid om direct ex vivo nauwkeurige opsporing Ag-specifieke CD8 ⁺ T-cellen zonder de noodzaak van in vitro her-stimulatie. Bovendien is de combinatie van pMHC-I tetrameer kleuring met multi-color flowcytometrie heeft gedetailleerde analyse van het differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus van Ag-specifieke CD8 ⁺ T-cellen ^2-4 toegestaan. In het licht van de recente technische ontwikkelingen voor het karakteriseren van CD8 ⁺ T-cel repertoire pMHC-I multimeer kleuring ^6, de breedte van de aanvragen for deze methode zal waarschijnlijk blijven uitbreiden.

Er zijn maar weinig gebieden in het biomedisch onderzoek zijn meer geprofiteerd van pMHC-I tetrameer kleuring dan het gebied van HIV immunologie ^7. Hoewel CD8 ⁺ T-cellen waren tijdelijk geassocieerd met de eerste controle van HIV viremie ten tijde van de publicatie door Altman, Davis en collega ^8,9, het gebruik van pMHC-I tetrameren in de daaropvolgende jaren aanzienlijk uitgebreid inzicht in de HIV-specifieke CD8 ⁺ T-celrespons. Zo pMHC-I tetrameer kleuring geholpen bevestigen de robuuste afmetingen van virus-specifieke CD8 ⁺ T-cel responsen in de meeste HIV-geïnfecteerden ^10-12. Deze werkwijze vergemakkelijkt eveneens de karakterisering van HIV en SIV-specifieke CD8 ⁺ T-celresponsen beperkt door MHC-I-moleculen geassocieerd met spontane controle van virale replicatie in de afwezigheid van antiretrovirale therapie-depressiviteit en "elite control" <sup> 13-15. Verder pMHC-I tetrameren waren instrumentaal bij de vaststelling van de geprogrammeerde dood 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) as als een omkeerbare route voor de disfunctionele fenotype van HIV-specifieke CD8 ⁺ T-cellen in ongecontroleerde chronische infectie ^16,17. Tezamen zijn deze studies onderstrepen het nut van pMHC-I tetrameren toezicht CD8 ⁺ T-celresponsen tegen het AIDS-virus.

Experimentele SIV infectie van rhesus makaken (Macaca mulatta) blijft de beste diermodel voor het evalueren van immune interventies tegen HIV / AIDS ^18,19. In de afgelopen 25 jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de identificatie en karakterisering van SIV-specifieke CD8 ⁺ T-cellen in deze apensoorten, waaronder de ontdekking van MHC-I-allelen en de definitie van de peptide binding motieven ^13,20-27 . Als gevolg daarvan hebben pMHC-I tetrameren ontwikkeld voor de analyse van SIV-specifieke CD8 ⁺ T-cellreacties in dit diermodel ^28. De meeste van deze sera worden gemaakt van de genproducten van vier rhesus macaque MHC-I allelen: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, en Mamu-B * 017: 01. Van de nota, doe resusapen geen MHC-C locus ²⁹ te drukken. De overgrote meerderheid van de pMHC-I tetrameren gebruikt in de onderhavige experimenten werden geproduceerd op de NIH tetrameer Core Facility Emory University. Toch heeft een aantal van deze reagentia, met inbegrip van Mamu-A1 * 001 tetrameren gebonden aan de immunodominante Gag CM9 epitoop, kan alleen worden verkregen uit commerciële bronnen te wijten aan licentieovereenkomsten. Gebruik pMHC-I tetrameren van de vier rhesus macaque allelen bovenstaande, hebben we met succes genoemde CD8 ⁺ T-cellen tegen een totaal van 21 epitopen SIV (tabel 1), die werden geïnduceerd door vaccinatie of primaire SIV infectie ^30,31 (Martins et al., ongepubliceerde waarnemingen).

De huidige manuscript voorziet in eengeoptimaliseerde pMHC-I tetrameer kleuring protocol voor het bepalen van de frequentie en het geheugen fenotype van SIV-specifieke CD8 ⁺ T-cellen in rhesus makaken. De bepaling begint met een verkozen 30 min incuberen met een proteïne kinase remmer (PKI, hier Dasatinib wordt gebruikt) om TCR internalisatie verlagen en zo verbeteren pMHC-I tetrameer kleuring ^32. Zoals hieronder beschreven, deze behandeling is vooral nuttig bij gebruik Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Instructies over hoe de cellen met fluorochroom-geconjugeerde pMHC-I tetrameren en monoklonale antilichamen (mAbs) te labelen zijn ook aanwezig. Dit protocol een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire detectie van de cytolyse-geassocieerde molecule granzyme B (GZM B). Het mAb tegen CD3 toegevoegd in deze stap ook de detectie van deze TCR signaalmolecuul verbeteren. Als referentie zijn alle fluorochromen die in deze kleuring paneel weergegeven.