Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia⁺ Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

As células T CD8 ⁺ compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares ^1. Em termos simples, as células T CD8 ⁺ expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 ^+. No caso de uma célula T CD8 ⁺ específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 ⁺ e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 ⁺ podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas.

Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 ⁺ invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) ^2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) ⁺ células-T CD8 espec�icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de ^Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I ^5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 ⁺ específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 ⁺ específicas de células ^Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 ⁺ por pMHC-I multimero coloração ^6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão.

Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV ^7. Embora as células T CD8 ⁺ foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas ^8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 ^+. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 ⁺ específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV ^10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 ⁺ restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como "controlo de elite" <sup> 13-15. Além disso, pMHC-I tetrâmeros foram instrumental no estabelecimento do eixo morte programada 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como uma via reversível para o fenótipo disfuncional de HIV-específicas CD8 ⁺ células-T na infecção crônica não controlada ^16,17. Coletivamente, esses estudos ressaltam a utilidade de tetrâmeros pMHC-I para monitorar as respostas de células T CD8 ⁺ contra o vírus da AIDS.

Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS ^18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas ^SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos ^13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 ⁺respostas neste modelo animal ^28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C ^29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 ⁺ contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário ^30,31 (Martins et al., observações não publicadas).

O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 ⁺ frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração ^32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.