Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8⁺ T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

CD8 ⁺ T-Zellen umfassen eine entscheidende Komponente des adaptiven Immunsystems , wie sie in Tumor – Immunüberwachung und tragen zur Eradikation intrazellulärer Pathogene ¹ teilnehmen. In einfachen Worten auszudrücken CD8 ⁺ T-Zellen T-Zell – Rezeptoren (TCR) , die spezifisch Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC–I) Moleküle auf der Plasmamembran der Wirtszellen erkennen. Da diese Peptide aus der Proteolyse von endogen synthetisierten Proteinen, Zelloberflächen pMHC-I-Komplexe liefern ein Fenster in die intrazelluläre Umgebung abgeleitet werden. Nach der Virusinfektion, zum Beispiel, werden infizierte Zellen zeigen MHC-I – Moleküle Virus abgeleitete Peptide enthält , die als Liganden für TCRs ausgedrückt durch patrouillieren CD8 ⁺ T-Zellen dienen kann. Im Falle einer infizierten Zelle präsentiert ein Virus-spezifischen CD8 ⁺ T-Zelle ihre pMHC-I – Liganden trifft, wird TCR Eingriff resultieren in CD8 ⁺ T-Zell – Aktivierung und ultifähr führen Zell-Lyse zu zielen. In Anbetracht der kritischen Natur dieser TCR / pMHC–I – Wechselwirkungen, die Bestimmung der Größe, Spezifität und Phänotyp reagieren CD8 ⁺ T-Zellen können offenbaren oft wichtige Hinweise auf Krankheiten beim Menschen.

Bis in die frühen 1990er Jahre, die Quantifizierung von Ag-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen auf der technisch anspruchsvollen Grenzverdünnung Assays herangezogen (LDA) ^2,3. Nicht nur, dass mehrere Tage die LDA erfordern abgeschlossen werden, ist es auch nicht, Zellen zu erkennen, die proliferative Potential fehlte. Als Ergebnis unterschätzt die LDA in beträchtlichem Ausmaß die tatsächliche Häufigkeit von Antigen (Ag) -spezifische CD8 ⁺ T-Zellen in einer Immunantwort beteiligt. Obwohl die Entwicklung von ELISPOT und intrazellulären Zytokin – Färbung Assays die Fähigkeit stark verbesserte zelluläre Immunität zu messen, benötigt diese Methoden noch in – vitro – Stimulation zur Quantifizierung von Ag-spezifischen T-Zellen ^4. Erst 1996, dass Altman, Davis, und colleagues ihre Wahrzeichen Artikel veröffentlicht , die Entwicklung der ⁵ – Technologie pMHC–I Tetramer berichten. Entscheidend für den Erfolg dieser Technik war die Multimerisierung von pMHC-I-Moleküle, die die Halbwertszeit von TCR / pMHC-I-Wechselwirkungen erweitert, wodurch die Wahrscheinlichkeit pMHC-I Tetramere während der Waschschritte von durchflusszytometrischen Assays Abfallen reduzieren. Der Hauptvorteil der pMHC-I – Tetramere in den vorgenannten Tests ist die Fähigkeit, genau Ag-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen direkt ex vivo , ohne die Notwendigkeit für in vitro Restimulation detektieren. Darüber hinaus hat die Kombination von pMHC-I Tetramer – Färbung mit Mehrfarben – Zytometrie detaillierte Analysen der Differenzierungsstufe, Speicher Phänotyps erlaubt fließen und Aktivierungsstatus von Ag-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen ^2-4. In Anbetracht der jüngsten technischen Fortschritte für die Charakterisierung von CD8 ⁺ T-Zell – Repertoires durch pMHC–I – Multimer Färbung ^6, die Breite der Anwendungen for diese Methode ist wahrscheinlich, weiter zu wachsen.

Nur wenige Gebiete in der biomedizinischen Forschung haben mehr profitierte von pMHC–I Tetramerfärbung als dem Gebiet der HIV Immunologie ^7. Obwohl CD8 ⁺ T-Zellen zeitlich mit der anfänglichen Kontrolle der HIV – Virämie durch den Zeitpunkt der Veröffentlichung von Altman, Davis und Kollegen ^8,9 in Verbindung gebracht worden war, unser Verständnis für die Verwendung von pMHC–I Tetrameren in den folgenden Jahren deutlich ausgebaut die HIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zell – Antwort. Zum Beispiel half pMHC-I Tetramerfärbung die robust Größe von Virus-spezifischen CD8 ⁺ T-Zell – Reaktionen in den meisten HIV-infizierten Personen ^10-12 bestätigen. Diese Methode erleichtert auch die Charakterisierung von HIV- und SIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zell – Antworten beschränkt durch MHC-I – Moleküle mit spontaner Kontrolle der viralen Replikation in Abwesenheit von antiretroviralen Therapie-Phänomen als "Elite – control" bekannt assoziiert <sup> 13-15. Weiterhin wurden pMHC-I Tetramere instrumental bei der Festlegung der programmierten Tod 1 (PD-1) / PD – Ligand 1 (PD-L1) Achse als reversible Weg für die dysfunktionale Phänotyp von HIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen in unkontrollierter chronischen Infektion ^16,17. Zusammenfassend unterstreichen diese Studien die Nützlichkeit pMHC-I Tetramere zur Überwachung CD8 ⁺ T-Zell – Reaktionen gegen das AIDS – Virus.

Experimentelle SIV – Infektion von Rhesusaffen (Macaca mulatta) bleibt das beste Tiermodell für ^18,19 Immun Interventionen gegen HIV / AIDS zu bewerten. In den letzten 25 Jahren erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von SIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen in dieser Affenarten, einschließlich der Entdeckung von MHC-I – Allele und die Definition von Peptid – Bindungsmotive hergestellt ^13,20-27 . Als Ergebnis wurden für die Analyse von SIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zell – pMHC-I Tetramere entwickelteAntworten in diesem Tiermodell ^28. Die meisten dieser Reagenzien werden der Genprodukte von vier Rhesusaffe MHC-I – Allele hergestellt: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01 und Mamu-B * 017: 01. Zu beachten ist , Rhesusmakaken exprimieren keine MHC-C – Locus ^29. Die überwiegende Mehrheit der pMHC–I-Tetramere in den vorliegenden Experimenten verwendet wurden bei der NIH Tetramer Core Facility an der Emory University produziert. Dennoch können einige dieser Reagenzien, einschließlich Mamu-A1 * 001 Tetrameren die immuno-Gag CM9 Epitop gebunden ist, nur aus kommerziellen Quellen aufgrund von Lizenzverträgen erworben werden. Verwendung pMHC-I Tetramere der vier Rhesusaffe Allele oben aufgeführten haben wir erfolgreich aufgezählt CD8 ⁺ T-Zellen gegen insgesamt 21 Epitope SIV (Tabelle 1), die durch Impfung oder primäre SIV – Infektion ^30,31 (Martins et induziert wurden al., nicht veröffentlichte Beobachtungen).

Die vorliegende Manuskript stellt einoptimiert pMHC-I Tetramer Färbeprotokoll die Frequenz und die Speicher Phänotyp von SIV-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen in rhesus macaques zu bestimmen. Der Test beginnt mit einer elektiven 30 min Inkubation mit einem Proteinkinase – Inhibitor (PKI, hier Dasatinib verwendet wird), um TCR – Internalisierung zu verringern und dadurch verbessern pMHC-I Tetramer ³² Anfärbung. Wie unten beschrieben, ist diese Behandlung besonders nützlich, wenn Mamu-B * 017 unter Verwendung von: 01-Tetramere. Die Anleitung, wie die Zellen mit fluorochromkonjugierten pMHC–I Tetrameren und monoklonale Antikörper (mAb) zu beschriften sind ebenfalls vorhanden. Dieses Protokoll umfasst auch eine Zellpermeabilisierung Schritt für die intrazellulären Nachweis des Zytolyse-assoziierten Moleküls Granzym B (GZM B). Der mAb gegen CD3 wird bei diesem Schritt hinzugefügt, und Nachweis dieses TCR Signalmoleküls zu verbessern. Als Referenz, die alle in dieser Färbung Platte eingesetzt Fluorochrome werden aufgelistet.