כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.
פפטיד-מרכזי histocompatibility מורכבת אני בכיתה (pMHC-I) tetramers היה כלים רבים ערך כדי ללמוד CD8 + תגובות תאי T. בגלל ריאגנטים אלה ישירות לאגד קולטני תאי T על פני השטח של CD8 + לימפוציטים מסוג T, שכותרתו fluorochrome tetramers pMHC-לי לאפשר זיהוי מדויק של אנטיגן (Ag) -specific CD8 + T-תאים ללא צורך במבחנה מחדש -גְרִיָה. יתר על כן, בשילוב עם צבע רב cytometry זרימה, pMHC-לי tetramer מכתים יכול לחשוף היבטים מרכזיים של Ag ספציפי CD8 + T-תאים, כולל שלב התמיינות, פנוטיפ זיכרון, מצב ההפעלה. מחקרים מסוג זה כבר שימושי במיוחד בתחום האימונולוגיה HIV שבו CD8 + T-תאים יכולים להשפיע על התפתחות לאיידס. זיהום ניסיוני של קופי רזוס בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) מספק כלי רב ערך כדי ללמוד חסינות הסלולר נגד נגיף האיידס. כתוצאה מכך, progre ניכרss נעשה בהגדרה ואפיון תגובות T-cell במודל חיה זו. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס ידי מכתים tetramer pMHC-לי. Assay שלנו מאפשר phenotyping כימות וזיכרון סימולטני של שתי אוכלוסיות pMHC-לי tetramer + CD8 + T-cell לכל מבחן, אשר יכול להיות שימושי לצורך מעקב תגובות SIV ספציפי CD8 + T-cell שנוצר על ידי חיסון או זיהום SIV. בהתחשב הרלוונטי של פרימטים לא אנושיים במחקר ביו, מתודולוגיה זו ישימה ללימוד תגובות CD8 + T-cell במסגרות מחלה נפוצה.
CD8 + T-תאים מהווים מרכיב חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית כפי שהוא להשתתף מעקב חיסוני גידול ולתרום מיגור פתוגנים תאיים 1. במילות פשוטות, CD8 + T-תאים לבטא קולטנים T-cell (TCRs) כי דווקא מכירים בכיתה מורכבת histocompatibility-מרכזי פפטיד אני (pMHC-I) מולקולות נוכחיות מופעל על הממברנה של תאי מארחים. מאז פפטידים אלה נגזרים proteolysis של חלבונים מסונתזים באופן אנדוגני, pMHC-I פני תא מתחמים פותחים בפנינו צוהר אל הסביבה התאית. עם זיהום בנגיף, למשל, תאים נגועים יציגו מולקולות MHC-I המכילות פפטידים שמקורם וירוס שיכול לשמש ligands עבור TCRs שהביע מסיירי CD8 + T לתאים. במקרה וירוס ספציפי CD8 + T-cell פוגש תא נגוע ההצגה ליגנד pMHC-I שלה, מעורבות TCR תגרום CD8 + T-cell הפעלת ultimately להוביל למקד תמוגה התא. בהתחשב באופי הקריטי של אינטראקציות TCR / pMHC-לי אלה, לקביעת הגודל, הסגוליים פנוטיפ להגיב CD8 + T-תאים לעתים קרובות יכול לחשוף רמזים חשובים על מחלות אנושיות.
עד תחילת 1990, כימות של Ag ספציפי CD8 + T-תאי הסתמכה על assay דילול בדרישה להגביל טכנית (LDA) 2,3. לא זו בלבד LDA לדרוש כמה ימים להסתיים, זה גם לא הצליח לאתר תאים חסרי פוטנציאל שגשוג. כתוצאה מכך, LDA לזלזל בהרבה התדירות בפועל של אנטיגן (Ag) CD8 + T-תאי -specific השתתפות תגובה חיסונית. למרות הפיתוח של ELISPOT מבחני מכתים ציטוקינים תאיים מאוד שיפר את היכולת למדוד חסינות הסלולר, שיטות אלה עדיין יש צורך גירוי במבחנה לכימות Ag ספציפי מתאי T 4. זה לא היה עד 1996 אלטמן, דייויס, ואת הפיצוץeagues פרסם מאמר ציון הדרך שלהם ולדווח על ההתפתחות של טכנולוגית tetramer pMHC-לי 5. קריטי להצלחה של טכניקה זו הייתה multimerization של מולקולות pMHC-I, אשר האריך את זמן מחצית החיים של אינטראקציות TCR / pMHC-I, ובכך להפחית את ההסתברות של tetramers pMHC-לי ליפול במהלך השלבים כביסה של מבחני תזרים cytometric. היתרון העיקרי של tetramers pMHC-לי על מבחני הנ"ל היא היכולת לזהות במדויק Ag ספציפי CD8 + T-תאים ישירות vivo לשעבר ללא צורך גירוי מחדש במבחנה. מעבר לכך, השילוב של מכתים tetramer pMHC-לי עם צבע רב cytometry זרימה אפשר ניתוחים מפורטים של שלב הבידול, פנוטיפ זיכרון, מצב הפעלה של Ag ספציפי CD8 + T-תאי 2-4. לאור התקדמות טכנית האחרונה לאפיון רפרטוארי CD8 + T-cell ידי pMHC-לי multimer מכתים 6, את רוחב היריעה של יישומי FOr מתודולוגיה זו צפויה להימשך מתרחבת.
אזורים מעטים במחקר ביו היה ליהנות יותר מכתים tetramer pMHC-לי מאשר בתחום האימונולוגיה HIV 7. למרות CD8 + T לתאים היו קשורים באופן זמני באמצעות השלט הראשוני של viremia HIV עד מועד הפרסום ידי אלטמן, דייויס, ועמיתיו 8,9, השימוש tetramers pMHC-לי בשנים שלאחר מכן הרחיב את הבנתנו משמעותית של תגובת CD8 + T-cell הספציפית ל- HIV. לדוגמא, מכתים tetramer pMHC-עזר לאשר את הגודל החזק של תגובות וירוס ספציפי CD8 + T-cell ברוב האנשים שנדבקו ב- HIV 10-12. מתודולוגיה זו גם כדי להקל על האפיון של HIV- ו SIV ספציפי תגובות CD8 + T-cell המוגבל על ידי מולקולות MHC-I הקשורות בשליטה ספונטנית של תרבות נגיף בהעדר-טיפול בתופעה תרופתית המכונה "שליטת אליטה" <sup> 13-15. יתר על כן, tetramers pMHC-לי סייע בהקמת מוות המתוכן 1 (PD-1) / PD ליגנד 1 (PD-L1) הציר כמו מסלול הפיך עבור הפנוטיפ מתפקדת הספציפי ל- HIV CD8 + T-תאי זיהום כרוני בלתי מבוקר 16,17. ככלל, מחקרים אלה מדגישים את התועלת של tetramers pMHC-לי לניטור CD8 + T-cell תגובות נגד נגיף האיידס.
זיהום ניסיוני SIV של קופי רזוס (מולאטית מאכאכה) נשאר מודל החיה הכי הטוב להערכת התערבויות חיסון נגד HIV / איידס 18,19. ב -25 השנים האחרונות, התקדמות משמעותית נעשתה זיהוי ואפיון של SIV ספציפי CD8 + T-תאי במינים זה קוף, לרבות גילוי אללים MHC-I ו- ההגדרה של מוטיבים מחייב פפטיד 13,20-27 . כתוצאה מכך, tetramers pMHC-לי פותח לניתוח SIV הספציפי CD8 + T-cellתגובות במודל החיה הזאת 28. רוב ריאגנטים אלה עשויים המוצרים הגן של ארבעה אללים רזוס מקוק MHC-I: ממו-A1 * 001, ממו-A1 * 002: 01, * ממו-B 008: 01, ו ממו-B * 017: 01. ראוי לציין, קופי רזוס מחווים מוקד MHC-C 29. הרוב המכריע של tetramers pMHC-השתמשתי בניסויים הנוכחי הופקו במתקן Core NIH tetramer באוניברסיטת אמורי. עם זאת, חלק ריאגנטים אלה, כולל ממו-A1 * 001 tetramers מאוגד epitope Gag CM9 immunodominant, ניתן להשיג רק ממקורות מסחריים בשל הסכמי רישוי. Tetramers pMHC-לי שימוש של ארבעה אללים מקוק רזוס המפורטים לעיל, יש לנו המנויים בהצלחה CD8 + T-תאי נגד סך של 21 אפיטופים SIV (טבלה 1), שהיו המושרה על ידי חיסון או זיהום SIV העיקרי 30,31 (et מרטינס al., תצפיות לא פורסם).
כתב היד הנוכחי מספקתpMHC-לי tetramer מכתים מותאם פרוטוקול לקביעת פנוטיפ תדירות וזיכרון של SIV ספציפי CD8 + T-התאים קופי רזוס. את assay מתחיל עם הדגירה אלקטיבי 30 דקות עם מעכב קינאז חלבון (PKI; כאן, dasatinib משמש) על מנת להקטין הפנמה TCR ובכך לשפר pMHC-לי tetramer מכתים 32. כפי שנראה בהמשך, הטיפול הזה הוא שימושי במיוחד בעת השימוש ממו-B * 017: 01 tetramers. הוראות כיצד לתייג את התאים עם tetramers fluorochrome מצומדות pMHC-I ו- נוגדנים חד שבטיים (מבז) ניתנים גם. פרוטוקול זה כולל גם צעד התא permeabilization לאיתור התאי של B granzyme המולקולה הקשורים cytolysis (Gzm B). מב נגד CD3 מתווספת בשלב זה, כמו גם כדי לשפר את היכולת לזהות מולקולת איתות TCR זה. כהפניה, כל fluorochromes מועסק לוח מכתים זה מפורט.
כמה צעדים שידונו בו הליך זה כיוון שהן חיוניות על כניעתה תוצאות אופטימליות. ראשית, מאז איכות הדגימות הביולוגיות היא מנבא חזק של ההצלחה של כל assay תזרים cytometric 38, כל הטיפול יש לנקוט כדי להבטיח כי התאים הם קיימא וב ההשעיה במהלך ההליך המכתים. זה רלוונטי במיוחד כאשר עוב?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות דוד ווטקינס לתמיכה בניסויים שאפשרו אופטימיזציה של המתודולוגיה הנוכחית. מחקר מדווח בפרסום זה מומן בחלקו על ידי מענק טייס שמספק מרכז מיאמי לאיידס מחקר של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30AI073961. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.
Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20°C |
RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μL of DMSO prior to use. |
Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Sarsdet Tubes 1.5mL screw top | VWR | 72.692.005 | |
2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
Centrifuge | To discretion of scientist | ||
4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
Deionized water | |||
Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
FACS Diva software | BD Biosciences | ||
Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
Micropippette tips |