Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid – Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA – Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins ¹ zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch ³² P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin ² oder Digoxigenin (DIG) ³ (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün – Färbung der PAGE – Gels ^4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff – Konjugate durch das Gel ^5,6 scannen.

Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA – Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale ^1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- ² oder DIG-konjugierten ³ DNA – Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz ⁶ detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel – Färbung und einen fluoreszierenden Scanner ^4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff – Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, Fluorescein ⁹ und Infrarot – Fluoreszenzfarbstoffe ^4-6.

Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense – Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen ^5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA – Zielstellen ^5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase – Reporter – Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 ^G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 ^G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA – Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 ^G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt.

Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils ^5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA – Bindung von SOX-2 und SOX-2 ^G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA – Analyse zeigte , dass SOX-2 ^G73E nicht die DNA – Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 ^G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA – Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) ^5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA – Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 ^G73E – Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 ^G73E zusammen mit Infrarot – Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA – Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.