Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati
Summary
Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.
Abstract
Elettroforetiche saggi Mobility Shift (EMSA) sono uno strumento fondamentale per caratterizzare le interazioni tra proteine e le loro sequenze di DNA bersaglio. La radioattività è stato il metodo predominante di etichettatura DNA in EMSAs. Tuttavia, recenti progressi nella coloranti fluorescenti e metodi di scansione hanno spinto l'uso di marcatura fluorescente di DNA come alternativa alla radioattività per i vantaggi di maneggevolezza, risparmiando tempo, riducendo i costi e migliorare la sicurezza. Abbiamo recentemente utilizzato EMSA fluorescente (Femsa) per affrontare con successo un importante questione biologica. La nostra analisi FEMSA fornisce una visione meccanicistica in l'effetto di una mutazione missenso, G73E, nel HMG fattore di trascrizione altamente conservata SOX-2 on olfattiva diversificazione tipo neurone. Abbiamo scoperto che mutante SOX-2 proteina G73E altera il DNA specifica attività di legame, causando in tal modo olfattiva trasformazione neurone identità. Qui, vi presentiamo un ottimizzato e conveniente step-by-step di protocolloper Femsa utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti e purificati SOX-2 proteine (WT e mutanti SOX-2 proteine G73E) come un esempio biologico.
Introduction
EMSAs sono utilizzati per analizzare interazioni tra DNA e proteine utilizzando nativo SDS-PAGE (PAGINA) per risolvere una miscela di una proteina di interesse e una sonda di DNA marcata contenente potenziali siti bersaglio della proteina 1. Una sonda DNA legato con proteine migrerà più lento rispetto a una sonda di DNA libero, ed è quindi ritardato nella sua migrazione attraverso una matrice di poliacrilammide. Radiomarcatura di DNA da 32 P è stato il metodo predominante per il rilevamento in EMSAs. Anche se l'applicazione di radiomarcatura in ricerca biochimica è stato vantaggioso, i metodi di etichettatura DNA alternativa con sensibilità paragonabile vengono impiegati a causa dei rischi per la salute e la sicurezza connessi con la gestione di radioattività. Questi metodi alternativi includono coniugazione del DNA con biotina 2 o digossigenina (DIG) 3 (entrambi i quali sono poi rilevati dai sistemi chemiluminescenza), SYBR colorazione verde del gel PAGE 4,o il rilevamento diretto di coniugati colorante DNA fluorescente attraverso la scansione del 5,6 gel.
I gel risolti di EMSAs utilizzando sonde di DNA marcati radioattivamente richiedono l'elaborazione postrun attraverso film autoradiografia o un sistema phosphorimager di rilevare i segnali radioattivi 1,7. Gel di EMSAs utilizzando biotin- 2 o DIG-coniugati sonde 3 di DNA devono essere elaborati e trasferiti su una membrana adatta e poi rilevati da chemiluminescenza 6. SYBR colorazione verde del gel richiede postrun colorazione del gel e uno scanner a fluorescenza 4. Dal momento che sono necessari fasi di lavorazione gel postrun per EMSAs che utilizzano queste tecniche di etichettatura di DNA, il gel può essere risolto solo una volta analizzati. Al contrario, sonde di DNA marcate con fluorofori possono essere rilevati direttamente nel gel all'interno delle lastre di vetro da uno scanner. Pertanto, le interazioni proteina-DNA possono essere monitorati e analizzati più volte in diversi momenti durante la corsa, cheriduce significativamente i tempi ei costi. I coniugati colorante DNA fluorescente che sono stati utilizzati per EMSAs includono Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceina 9, e coloranti fluorescenti infrarossi 4-6.
Regolazione trascrizionale richiede interazioni proteina-DNA di fattori di trascrizione e dei loro geni bersaglio. Il coordinamento di queste interazioni genera diversi tipi di cellule da un progenitore comune durante lo sviluppo degli animali. Uno schermo genetica avanti imparziale identificato una mutazione missense, G73E, nel altamente conservato dominio HMG di legame al DNA del Caenorhabditis elegans fattore di trascrizione SOX-2. I risultati mutazione in una trasformazione dell'identità cellulare dei neuroni olfattivi AWB in AWC neuroni olfattivi a livello molecolare, morfologico e funzionale 5,10. SOX-2 regola in maniera differenziale la differenziazione terminale dei neuroni AWB e AWC interagendo con fattori socio di trascrizione dipendenti dal contesto e rispettivoSiti bersaglio DNA 5,10. SOX-2 partner con LIM-4 (LHX) in terminale AWB differenziamento neuronale, mentre SOX-2 partner con CEH-36 (OTX / OTD) in terminale AWC differenziamento neuronale. Saggi di luciferasi mostrano che SOX-2 e mutante SOX-2 proteine G73E avere interazioni cooperative con cofattori trascrizionali LIM-4 e CEH-36 per attivare un promotore espresso nei neuroni AWB e AWC. Tuttavia, SOX-2 e mutante SOX-2 G73E visualizzate le proprietà di attivazione differenziale del promotore. Per studiare le basi molecolari del DNA differenziali attività vincolanti SOX-2 e SOX-2 G73E, fEMSAs sono stati eseguiti con queste proteine e le loro potenziali siti bersaglio.
In primo luogo, un approccio bioinformatica è stato preso per identificare il DNA biologicamente rilevante sequenze di legame all'interno della regione promotrice 1 kb usati nel saggio luciferasi. Dal momento che più potenziali SOX-2 siti di legame erano presenti in tutto il promotore, ci siamo concentratiil predetto SOX-2 siti di legame adiacenti putativo CEH-36 o LIM-4 siti di legame e evolutivamente conservati tra le varie specie di nematodi. Queste sequenze sono stati cancellati o mutati, e successivamente testati in vivo per la loro attività di esprimere GFP transgeni giornalista nei neuroni AWB o AWC. Grazie a questo approccio, abbiamo identificato potenziali LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX siti bersaglio adiacenti / che sono specificamente richiesti per l'espressione di GFP in AWB e AWC neuroni, rispettivamente 5. Abbiamo studiato le potenziali differenze nel legame al DNA di SOX-2 e SOX-2 G73E utilizzando FEMSA con le identificati LIM-4 / SOX-2 e CEH-36 / SOX-2 siti bersaglio adiacenti. La nostra analisi ha mostrato che EMSA SOX-2 G73E non vincola la sonda di DNA che contiene le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti (necessari per l'espressione genica in AWB) nel modo più efficiente WT SOX-2 ha fatto. Tuttavia, SOX-2 e SOX-2 G73E avevano alcuna differenza nel legame della sonda di DNA che contiene il CEH-36 / SOX-2 unsito di destinazione djacent (necessaria per l'espressione genica in AWC) 5,10. Il nostro FEMSA analizza fornire la comprensione meccanicistica della natura del G73E mutazione SOX-2 in interessano specifica attività di legame al DNA per l'identità delle cellule trasformazione fenotipo AWB-to-AWC. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato di FEMSA utilizzando 6xHis-SOX-2 purificati o 6xHis-SOX-2 G73E insieme a fluorescenza a raggi infrarossi sonde di DNA dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs sono uno strumento efficace per studiare le interazioni proteina-DNA, e sono una alternativa alla marcatura radioattiva del DNA. Coloranti fluorescenti come coloranti infrarossi sono disponibili in commercio, e forniscono un metodo più sicuro e più ecologico rispetto all'etichettatura DNA radioattivo. EMSAs utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato non richiedono fasi di lavorazione gel postrun, e quindi risparmiare tempo e costi rispetto ad altre tecniche di marcatura del DNA. Il temp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
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