Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués
Summary
Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.
Abstract
Les analyses électrophorétiques de décalage de mobilité (EMSA) sont un outil instrumental pour caractériser les interactions entre les protéines et leurs séquences d'ADN cibles. Radioactivité a été la principale méthode de marquage d'ADN dans EMSA. Cependant, les progrès récents dans les colorants fluorescents et les méthodes d'analyse ont conduit à l'utilisation d'un marquage fluorescent de l'ADN comme une alternative à la radioactivité pour les avantages de la facilité de manipulation, un gain de temps, ce qui réduit le coût et en améliorant la sécurité. Nous avons récemment utilisé EMSA fluorescent (FEMSA) pour traiter avec succès une question biologique importante. Notre analyse FEMSA fournit une approche mécanistique dans l'effet d'une mutation faux-sens, G73E, dans le HMG facteur de transcription SOX-2 hautement conservée sur la diversification du type de neurone olfactif. Nous avons constaté que mutantes SOX-2 protéines G73E modifie l' activité de liaison spécifique de l' ADN, provoquant ainsi olfactive transformation identitaire des neurones. Ici, nous présentons un optimisé et rentable, étape par étape protocolepour FEMSA en utilisant des oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents et purifiés SOX-2 protéines (WT et mutantes SOX-2 protéines G73E) comme un exemple biologique.
Introduction
EMSA sont utilisés pour analyser les interactions entre l' ADN et les protéines en utilisant l' électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE) pour résoudre un mélange d'une protéine d'intérêt et une sonde d'ADN marquée contenant des sites cibles potentiels de la protéine 1. Une sonde d'ADN liée à la protéine migre plus lentement par rapport à une sonde d'ADN libre, et est donc retardé dans sa migration à travers une matrice de polyacrylamide. Le marquage radioactif de l' ADN par 32P a été la principale méthode pour la détection dans EMSA. Bien que l'application de radiomarquage dans la recherche biochimique a été bénéfique, les méthodes de remplacement marquage d'ADN avec une sensibilité comparable sont employés en raison des risques pour la santé et la sécurité associés à la radioactivité de manutention. Ces méthodes comprennent la conjugaison de l' ADN avec de la biotine ou la digoxigénine 2 (DIG) 3 (dont les deux sont ensuite détectés par des systèmes de chimioluminescence), SYBR coloration verte des gels PAGE 4,ou la détection directe des conjugués colorant ADN fluorescent en scannant le 5,6 gel.
Les gels de résolus EMSA en utilisant des sondes d'ADN radiomarquées nécessitent un traitement postrun à travers des films d'autoradiographie ou un système Phosphorimager pour détecter des signaux radioactifs 1,7. Gels de 2 EMSA à l' aide de biotine ou DIG-conjugués sondes d'ADN 3 doivent également être traitées et transférées sur une membrane appropriée et ensuite détectés par chimioluminescence 6. SYBR coloration verte du gel nécessite une coloration de gel postrun et un scanner fluorescent 4. Etant donné que les étapes de traitement de gel de postrun sont nécessaires pour EMSA à l'aide des techniques de marquage d'ADN, le gel peut être résolu doser une seule fois. En revanche, les sondes d'ADN marquées avec des fluorophores peuvent être directement détectés dans le gel à l'intérieur des plaques de verre par un scanner. Par conséquent, les interactions ADN-protéines peuvent être surveillés et analysés plusieurs fois à différents moments pendant la course, quiréduit considérablement le temps et le coût. Les conjugués de colorant d' ADN fluorescent qui ont été utilisés pour EMSA comprennent 6,8 Cy3, Cy5 6,8, 9 fluorescéine, et des colorants fluorescents infrarouges 4-6.
la régulation transcriptionnelle nécessite des interactions protéine-ADN des facteurs de transcription et de leurs gènes cibles. La coordination de ces interactions génère divers types de cellules à partir d'un ancêtre commun au cours du développement des animaux. Un écran avant génétique impartiale a identifié une mutation faux – sens, G73E, dans le domaine HMG liaison à l' ADN hautement conservée du Caenorhabditis elegans facteur de transcription SOX-2. Les résultats de mutation dans une transformation d'identité de cellule de AWB neurones olfactifs dans AWC neurones olfactifs aux niveaux moléculaires, morphologiques et fonctionnels 5,10. SOX-2 régule de façon différentielle la différenciation terminale des neurones AWB et AWC en interagissant avec des facteurs de transcription partenaire dépendant du contexte et respectiveDes sites cibles d'ADN. 5,10 SOX-2 partenaires avec LIM-4 (LHX) dans le terminal AWB différenciation neuronale, tandis que SOX-2 partenaires avec CEH-36 (OTX / OTD) dans le terminal AWC différenciation neuronale. Dosages de rapporteur luciférase montrent que SOX-2 et mutantes SOX-2 protéines G73E ont des interactions de coopération avec des cofacteurs de transcription LIM-4 et CEH-36 pour activer un promoteur exprimé dans les neurones AWB et AWC. Cependant, SOX-2 et mutant SOX-2 G73E affichent des propriétés d'activation différentielle du promoteur. Pour étudier la base moléculaire des activités de liaison d'ADN dérivées de SOX-2 et SOX-2 G73E, fEMSAs ont été réalisées avec ces protéines et leurs sites cibles potentiels.
En premier lieu, une approche de la bio-informatique a été d'identifier les séquences de liaison au sein de la région promotrice de 1 kb utilisée dans le dosage de la luciférase ADN biologiquement pertinent. Depuis plusieurs SOX-2 sites de liaison potentiels étaient présents tout au long du promoteur, nous nous sommes concentréssur SOX-2 sites de liaison prévus adjacents aux sites de liaison putative CEH-36 ou LIM-4 et évolutivement conservées entre les différentes espèces de nématodes. Ces séquences ont été supprimés ou mutés, et ensuite testés in vivo pour leur activité pour exprimer GFP transgènes rapporteurs dans les neurones AWB ou AWC. Grâce à cette approche, nous avons identifié 2-SOX sites cibles potentiels LIM-4 / SOX-2 et CEH-36 / adjacents qui sont spécifiquement nécessaires à l'expression de la GFP dans AWB et AWC neurones, respectivement 5. Nous avons étudié les différences possibles dans la liaison à l' ADN de SOX-2 et SOX-2 G73E utilisant FEMSA avec les CEH-36 / SOX-2 sites cibles adjacents identifiés LIM-4 / SOX-2 et. Notre analyse EMSA a montré que SOX-2 G73E ne se lie pas la sonde d'ADN contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents (requis pour l' expression génique dans AWB) aussi efficacement que WT SOX-2 ont fait. Cependant, SOX-2 et SOX-2 G73E avait pas de différence dans la liaison de la sonde d'ADN contenant le CEH-36 / SOX-2 adjacent site cible (requis pour l' expression génique dans AWC) 5,10. Notre analyse FEMSA donner un aperçu mécaniste de la nature de la mutation G73E SOX-2 affecter l' activité spécifique de liaison à l' ADN de l'identité cellulaire phénotype de transformation AWB à AWC. Ici, nous décrivons un protocole optimisé de FEMSA utilisant 6xHis-SOX-2 purifiés ou 6xHis-SOX-2 G73E avec fluorescentes infrarouge sondes d'ADN marquées par un colorant contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents comme une étude de cas pour faire face une question biologique importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs sont un outil efficace pour étudier les interactions protéine-ADN, et sont une alternative à un marquage radioactif de l'ADN. Les colorants fluorescents tels que les colorants infrarouges sont disponibles dans le commerce, et de fournir une méthode plus sûre et plus respectueuse de l'environnement par rapport à l'étiquetage radioactif de l'ADN. EMSA utilisant fluorescentes infrarouge oligonucléotides marqués par un colorant ne nécessitent pas d'étapes postrun de traitement de gel, e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
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