Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

EMSAs se utilizan para analizar las interacciones entre el ADN y las proteínas mediante el uso de poliacrilamida nativo electroforesis en gel (PAGE) para resolver una mezcla de una proteína de interés y una sonda de ADN marcado que contiene los posibles sitios diana de la proteína ^1. Una sonda de ADN vinculados con la proteína migrará más lento en comparación con una sonda de ADN libre, y por lo tanto retraso en su migración a través de una matriz de poliacrilamida. El radiomarcado de ADN por ³² P ha sido el método predominante para la detección en EMSAs. Aunque la aplicación de radiomarcaje en la investigación bioquímica ha sido beneficioso, se están empleando métodos de marcaje de ADN alternativa con sensibilidad comparable debido a los riesgos de salud y seguridad asociados con el manejo de la radiactividad. Estos métodos alternativos incluyen la conjugación de ADN con biotina ² o digoxigenina (DIG) ³ (ambos de los cuales a continuación, son detectados por los sistemas quimioluminiscentes), SYBR verde tinción de los geles página ^4,o la detección directa de los conjugados de tinte de ADN fluorescente mediante el escaneo de la ^5,6 gel.

Los geles resueltos de EMSAs utilizando sondas de ADN marcadas radiactivamente requieren un procesamiento postrun a través de películas de autorradiografía o un sistema PhosphorImager para detectar señales radiactivas ^1,7. Los geles de EMSAs utilizando biotina ² o DIG conjugados sondas ³ de ADN también se deben procesar y se transfirieron a una membrana adecuada y luego detectados por quimioluminiscencia ^6. SYBR verde tinción del gel requiere tinción de gel postrun y un escáner de fluorescencia ^4. Dado que se requieren etapas de procesamiento gel postrun para EMSAs utilizando estas técnicas de marcaje de ADN, el gel resuelto se puede ensayar sólo una vez. En contraste, las sondas de ADN marcadas con fluoróforos pueden ser detectados directamente en el gel en el interior de las placas de vidrio por un escáner. Por lo tanto, las interacciones ADN-proteína se pueden monitorizar y se ensayaron varias veces a diferentes puntos de tiempo durante la ejecución, quereduce significativamente el tiempo y el costo. Los conjugados de tinte de ADN fluorescente que se han utilizado para EMSAs incluyen Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, fluoresceína ^9, y colorantes fluorescentes infrarrojos ^4-6.

Regulación transcripcional requiere interacciones proteína-ADN de factores de transcripción y sus genes diana. La coordinación de estas interacciones genera diversos tipos de células a partir de un antepasado común durante el desarrollo animal. Una pantalla de genética hacia adelante imparcial identificado una mutación de sentido erróneo, G73E, en el dominio de unión a ADN HMG altamente conservadas de la Caenorhabditis elegans factor de transcripción SOX-2. La mutación en una transformación de identidad celular de las neuronas olfativas AWB en AWC neuronas olfativas en los niveles moleculares, morfológicos y funcionales ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula la diferenciación terminal de AWB y AWC neuronas mediante la interacción con factores de transcripción dependientes del contexto socio y respectivaSitios diana de ADN ^5,10. SOX-2 se asocia con LIM-4 (LHX) en el terminal AWB diferenciación neuronal, mientras Sox-2 socios con CEH-36 (OTX / OTD) en terminal de la diferenciación neuronal AWC. Ensayos de reportero de luciferasa muestran que Sox-2 y mutantes Sox-2 ^G73E proteínas tienen interacciones cooperativas con cofactores de transcripción LIM-4 y CEH-36 para activar un promotor expresado en AWB y AWC neuronas. Sin embargo, SOX-2 y mutante SOX-2 ^G73E muestran propiedades de activación diferencial del promotor. Para investigar la base molecular de las actividades de unión de ADN diferenciales de SOX-2 y SOX-2 ^G73E, fEMSAs se realizaron con estas proteínas y sus sitios diana potenciales.

En primer lugar, se tomó un enfoque de la bioinformática para identificar las secuencias de unión dentro de la región del promotor 1 kb utilizado en el ensayo de luciferasa de ADN biológicamente relevante. Desde múltiples Sox-2 posibles sitios de unión estuvieron presentes durante todo el promotor, nos concentramosen los sitios de unión de SOX-2 predichos adyacentes a putativo CEH-36 o LIM-4 sitios de unión y evolutivamente conservadas entre diferentes especies de nematodos. Estas secuencias se eliminan o mutadas, y posteriormente se probaron in vivo para determinar su actividad para expresar transgenes reportero GFP en AWB o AWC neuronas. A través de este enfoque, hemos identificado posibles LIM-4 / SOX-2 y de la CEH-36-2 SOX sitios diana adyacentes / que se requieren específicamente para la expresión de GFP en AWB y AWC neuronas ^5, respectivamente. Se investigaron las posibles diferencias en el ADN vinculante de SOX-2 y Sox-2 ^G73E usando FEMSA con las CEH-36 / SOX-2 sitios diana adyacentes identificados LIM-4 / SOX-2 y. Nuestro análisis mostró que la EMSA SOX-2 ^G73E no se unió la sonda de ADN que contiene los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes (requeridos para la expresión de genes en AWB) tan eficientemente como WT Sox-2 lo han hecho. Sin embargo, Sox-2 y SOX-2 ^G73E no tenían ninguna diferencia en la unión de la sonda de ADN que contiene la CEH-36 / SOX-2 unasitio de destino djacent (necesario para la expresión de genes en AWC) ^5,10. Nuestra FEMSA analiza proporcionar una visión mecanicista de la naturaleza de la mutación ^G73E SOX-2 en afectar a la actividad de unión al ADN específico para la identidad de célula fenotipo de transformación AWB-a-AWC. A continuación, describimos un protocolo optimizado de FEMSA usando 6xHis-Sox-2 purificados o 6xHis-SOX-2 ^G73E junto con sondas de ADN marcados con colorante fluorescente infrarrojo que contienen los LIM-4 / SOX-2 sitios diana adyacentes como caso de estudio para abordar una importante cuestión biológica.