Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína ^1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por ³² P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem DNA alternativa com sensibilidade comparável estão sendo empregados devido aos riscos de saúde e segurança associados com a manipulação de radioatividade. Estes métodos alternativos incluem a conjugação de ADN com biotina ou digoxigenina ² (DIG) ³ (ambos os quais são então detectados por sistemas quimioluminescentes), SYBR verde de coloração dos géis página ^4,ou detecção direta de conjugados de corante de ADN fluorescente por digitalizar a ^5,6 gel.

Os géis resolvidos de EMSAs usando sondas de DNA marcadas radioactivamente requerem processamento postrun através de filmes auto-radiografia ou um sistema de phosphorimager para detectar sinais radioativos ^1,7. Géis de EMSAs utilizando biotina ou ^2-DIG conjugados com as sondas de ADN ³ também devem ser processados e transferidos para uma membrana adequada e, em seguida, detectados por quimioluminescência ^6. SYBR coloração verde do gel requer coloração de gel postrun e um scanner fluorescente ^4. Uma vez que as etapas de processamento de gel postrun são necessários para EMSAs utilizando estas técnicas de marcação de ADN, o gel pode ser resolvido ensaiados apenas uma vez. Em contraste, as sondas de ADN marcadas com fluoróforos pode ser detectada directamente no gel no interior das placas de vidro por um scanner. Portanto, as interacções ADN-proteína podem ser monitorizadas e ensaiado várias vezes a diferentes pontos de tempo durante a execução, quereduz significativamente o tempo e custo. Os conjugados de corante de ADN fluorescente que têm sido utilizados para EMSAs incluem ^6,8 Cy3, Cy5 ^{6,8, 9} fluoresceína, e corantes fluorescentes infravermelhos ^4-6.

A regulação transcricional requer interacções proteína-ADN de factores de transcrição e os seus genes-alvo. A coordenação dessas interações gera diversos tipos de células a partir de um antepassado comum durante o desenvolvimento animal. Uma frente tela genética não distorcida identificada uma mutação sem sentido, G73E, no domínio de ligação ao ADN de HMG altamente conservada do factor de transcrição de Caenorhabditis elegans SOX-2. Os resultados de mutação em uma transformação identidade da célula de AWB neurônios olfativos em AWC neurônios olfativos em níveis moleculares, morfológicos e funcionais ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula a diferenciação terminal dos neurônios AWB e AWC, interagindo com fatores sócio de transcrição dependentes do contexto e respectivaLocais-alvo DNA ^5,10. SOX-2 parceiros com LIM-4 (LHX) no terminal de AWB diferenciação neuronal, enquanto SOX-2 parceiros com CEH-36 (OTX / DTA) na diferenciação neuronal AWC terminal. Ensaios de repórter de luciferase mostram que SOX-2 e da SOX-2 mutantes proteínas ^G73E ter interações de cooperação com co-factores de transcrição LIM-4 e CEH-36 para ativar um promotor expresso em neurônios AWB e AWC. No entanto, SOX-2 e mutante SOX-2 ^G73E exibido propriedades de activação diferencial do promotor. Para investigar a base molecular da actividade de ligação ao ADN diferenciais de SOX-2 e SOX-2 ^G73E, fEMSAs foram realizados com estas proteínas e os seus locais alvo potenciais.

Em primeiro lugar, uma abordagem foi feita bioinformática para identificar as sequências de ligação no interior da região promotora do 1 kb usado no ensaio de luciferase de ADN biologicamente relevante. Desde várias-2 SOX locais de ligação potenciais estavam presentes ao longo do promotor, nós nos concentramosem sítios de ligação de SOX-2 preditos adjacentes ao putativo CEH-36 ou LIM-4 locais de ligação e evolutivamente conservados entre várias espécies de nemátodos. Estas sequências foram excluídos ou mutado, e posteriormente testado in vivo para a sua actividade para expressar transgenes repórter GFP em neurónios AWB ou AWC. Através desta abordagem, identificou potenciais LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX locais alvo adjacentes / que são especificamente necessárias para a expressão de GFP em neurónios AWB AWC e ^5, respectivamente. Nós investigamos as diferenças potenciais no DNA ligação de SOX-2 e da SOX-2 ^G73E usando FEMSA com as CEH-36 / SOX-2 locais alvo adjacentes identificadas LIM-4 / SOX-2 e. Nossa análise EMSA mostraram que SOX-2 ^G73E não se ligou a sonda de DNA contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes (necessários para a expressão do gene em AWB) tão eficientemente quanto WT SOX-2 fez. No entanto, SOX-2 e da SOX-2 ^G73E não tinha diferença na ligação da sonda de DNA contendo o CEH-36 / SOX-2 umsite de destino djacent (necessária para a expressão de genes em AWC) ^5,10. O nosso femsa análises fornecem uma visão mecanicista para a natureza da mutação ^G73E SOX-2 em afectar a actividade de ligação do ADN específico para a transformação de células fenótipo identidade AWB-a-AWC. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado da Femsa usando 6xHis-SOX-2 purificadas ou 6xHis-SOX-2 ^G73E em conjunto com sondas de DNA marcadas com corante fluorescente no infravermelho contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes como estudo de caso para enfrentar uma importante questão biológica.