Измерение ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО метилированных<em> INS</em> ДНК видов в образцах сыворотки человека как клетка смерти биомаркером Островок & beta;
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
Сахарный диабет 1 типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется разрушением инсулин-продуцирующих бета – клеток островка с помощью аутореактивных Т – клеток 1. Диагноз СД1, как правило, производится при измерении (глюкозы в крови> 200 мг / дл) гипергликемия в обедненной, молодого человека, который мог бы представить с кетоацидозом как свидетельство дефицита инсулина. На момент постановки диагноза СД1, имеются данные о существенной потере функции β клеток и массы (от 50 – 90%) 2. В клинических исследованиях, несколько иммунных модулирующих препаратов, которые были возбуждены в момент постановки диагноза привело к стабилизации функции β клеток (и, предположительно массы), но ни привели к клинической ремиссии заболевания, один важный вывод, поднял призыв к развитию биомаркеров для ранней диагностики заболевания и для продольного отслеживания эффективности комбинированной терапии 3,4. Усилия международных консорциумов, такаяS Человек Островок Исследовательская сеть Консорциума в национальных институтах Heath 5, подчеркнули необходимость разработки биомаркеров , которые сосредоточены на бета стресса и гибели клеток в СД1.
В соответствии с этими усилиями, наша группа и другие недавно разработали биомаркеров анализы на котором эта мера циркуляционные, эпигенетически модифицированные фрагменты ДНК , которые возникают в основном из умирающих -клеток 6 – 9. Во всех опубликованных анализов на сегодняшний день, внимание было сосредоточено на количественному кодирующего гена препроинсулин человека (INS), который демонстрирует большую степень неметилированных сайтов CpG в кодировании и промоторной области по сравнению с другими типами клеток. Освобождение неметилированных фрагментов ДНК ИНС была выдвинута гипотеза , как возникающие главным образом от смерти (некротические, апоптозе) -клеток. Наши недавние исследования показали , что в молодости, возвышенностей в обоих неметилированной и метилированной ДНК INS в положении -69 б.п. ( по отношению к тон сайт начала транскрипции) наблюдались в впервые выявленного СД1, и вместе служили в качестве специфических биомаркеров для этой группы населения 6. Эти биомаркеры анализы включают изоляцию бесклеточной ДНК из сыворотки или плазмы с использованием коммерческих наборов спин, с последующим превращением бисульфита выделенной ДНК (чтобы преобразовать без метилируется цитозина в урацила, оставляя метилированных цитозина нетронутыми).
В этом докладе мы опишем технические аспекты сбора образцов сыворотки, выделения бесклеточной ДНК из сыворотки, бисульфита преобразования, и производительность капельным цифровой ПЦР (далее, цифровой ПЦР) для дифференциально метилированной INS ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метилирование цитозина по метилтрансферазам ДНК позволяет эпигенетического контроля транскрипции у многих генов. Ген INS у человека почти исключительно выражается в островок бета клеток, и, как представляется, корреляция между частотой метилирования цитозина в гене INS , чтоб?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
