מדידת דיפרנציאלי Methylated<em> אח"י</em> DNA מינים בדגימות אדם סרום כמו מוות של תאים ביומרקר של איילט β
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית אשר מאופיינת על ידי ההרס של איון מייצר אינסולין β תאים על ידי תאי אוטוריאקטיבים T 1. האבחנה של T1D היא בדרך כלל מתבצעת בזמן המדידה של היפרגליקמיה (הגלוקוז בדם> 200 mg / dl) אצל אדם רזה וצעיר, עלול להוות עם בחמצת כעדות לחוסר באינסולין. בעת האבחנה של T1D, יש ראיות על אובדן משמעותי של תפקוד התא β ומסה (מ -50 – 90%) 2. במחקרים קליניים, מספר תרופות modulatory החיסונית שהונהגו בעת האבחנה הביאה להתייצבות של תפקוד התא β (ומן הסתם מסה), אבל אף אחד מהם לא הביא רמיסיה קלינית של מחלת, ממצא גייסה השיחה לפיתוח של סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של המחלה ועבור מעקב האורך של האפקטיביות של שילוב טיפול בעזרת 3,4. מאמצי קונסורציומים בינלאומיים, כזהזה הקונסורציום רשת המחקר איילט האדם במכונים הלאומיים של הית 5, הדגישו את הצורך לפתח סמנים ביולוגיים המתמקדים מתח מוות תאי β ב T1D.
עולה בקנה אחד עם המאמצים האלה, הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו לאחרונה מבחני סמן ביולוגי המודדים במחזור, קטעי דנ"א שונה epigenetically שעולים בעיקר ממוות תאי β 6 – 9. בכל המבחנים שפורסמו עד כה, הדגש היה על quantitation של preproinsulin קידוד הגן האנושי (INS), אשר מביא לידי ביטוי מעלות פחות או יותר של אתרי CPG unmethylated באזורי קידוד אמרגן בהשוואה לסוגי תאים אחרים. שחרור שברי DNA unmethylated אח"י שוער כמו הנובעת בעיקר ממוות (נמקי, אפופטוטיים) תאי β. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שלנו בנוער, הגבהים בשני DNA אח"י unmethylated ו מפוגל ב- BP עמדה -69 (ביחס ל- tהוא תעתיק להתחיל באתר) נצפו T1D חדש-onset, ויחד שימש סמנים ספציפיים לאוכלוסייה זו 6. מבחני סמן ביולוגי אלה כרוכים הבידוד של DNA התא מתוך סרום או פלזמה באמצעות ערכות ספין מסחרי, ואחריו המרה bisulfite של ה- DNA מבודד (להמיר cytosines הלא מפוגל כדי uracils, עוזב cytosines מפוגל ללא פגע).
בדו"ח זה, אנו מתארים את ההיבטים הטכניים של אוסף מדגם בסרום, בידוד של DNA התא מתוך בסרום, המרה bisulfite, והביצועים של PCR דיגיטלי אגל (להלן, דיגיטלי PCR) עבור ה- DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתילציה של cytosines ידי methyltransferases DNA מאפשרת השליטה אפיגנטיים של שעתוק גנים רבים. גן אח"י בבני האדם הוא כמעט לידי ביטוי אך ורק איון β תאים, נראה שיש קורלציה בין תדירות מתילציה של cytosines בגן INS כדי להשתיק של השעתוק שלה 11. ככזה, סוגי התאים ביותר מציגים תדירות ג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
