قياس تفاضلي مميثل<em> INS</em> أنواع الحمض النووي في عينات مصل الإنسان باعتباره موت الخلية العلامات البيولوجية للجزيرة β
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
مرض السكري نوع 1 (T1D) هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يتميز بها تدمير جزيرة المنتجة للانسولين β الخلايا عن طريق خلايا autoreactive تي 1. وعادة ما يتم التشخيص من T1D على قياس (الجلوكوز في الدم> 200 ملغ / دل) ارتفاع السكر في الدم في العجاف، فرد الشاب، الذي قد يقدم مع الحماض الكيتوني كدليل على نقص الأنسولين. في وقت التشخيص من T1D، وهناك أدلة لخسارة كبيرة في وظيفة خلايا β وكتلة (50-90٪) 2. في الدراسات السريرية، تبين أن العديد من الأدوية تغييري المناعة التي أقيمت في وقت التشخيص في تحقيق الاستقرار في وظيفة خلايا β (ويفترض الكتلة)، ولكن لا شيء قد أسفرت عن مغفرة السريرية للمرض، وهو الاكتشاف الذي أثار الدعوة إلى تطوير المؤشرات الحيوية للكشف في وقت سابق من هذا المرض وتتبع طولية من فعالية مجموعة من العلاجات 3،4. الجهود التي تبذلها اتحادات دولية، مثل هذاق كونسورتيوم شبكة البحوث جزيرة البشرية التابع للمعاهد الوطنية للهيث 5، وشدد على ضرورة تطوير المؤشرات الحيوية التي تركز على الإجهاد خلية بيتا والموت في T1D.
وتماشيا مع هذه الجهود، لدينا مجموعة والبعض الآخر قد وضعت مؤخرا فحوصات العلامات البيولوجية التي تقيس المتداولة، شظايا الحمض النووي تعديل epigenetically التي تنشأ في المقام الأول من الموت خلايا β 6-9. في جميع المقايسات التي نشرت حتى الآن، كان التركيز على الكميات من الجين البشري ترميز سلف طليعة الأنسولين (INS)، والذي يدل على درجة أكبر من المواقع الدليل السياسي الشامل unmethylated في المناطق الترميز والمروج مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا. كان الافتراض تحرير unmethylated شظايا الحمض النووي INS كما تنشأ أساسا من الموت (نخرية، أفكارك) خلايا β. وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن في الشباب، والارتفاعات في كل unmethylated والميثيلي والحمض النووي INS في موقف -69 سنة مضت (نسبة إلى Tانه النسخي بدء الموقع) لوحظت في الظهور الجديد T1D، وجنبا إلى جنب خدم المؤشرات الحيوية محددة لهذه الفئة من السكان 6. هذه المقايسات العلامات البيولوجية تنطوي على عزل الحمض النووي خالية من الخلايا من المصل أو البلازما باستخدام مجموعات تدور التجارية، تليها تحويل بيسلفيت لعزل الحمض النووي (لتحويل cytosines غير ميثليته إلى uracils، وترك cytosines ميثليته سليمة).
في هذا التقرير، وصفنا الجوانب التقنية لجمع عينة الدم، وعزل الحمض النووي خالية من الخلايا من الدم، وتحويل بيسلفيت، وأداء PCR الرقمي بالقطيرات (من الآن فصاعدا، PCR الرقمي) لميثليته تفاضلي INS الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مثيلة من cytosines التي كتبها ميثيل الحمض النووي يسمح لمراقبة جينية من النسخ في العديد من الجينات. وأعرب عن الجين INS في البشر على وجه الحصر تقريبا في جزيرة β خلايا، ويبدو أن هناك علاقة بين وتيرة مثيلة من cytosines في الجين INS لإسكات من النسخ في 11. على هذا النحو، ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
